THS-6596.pdf

traduit ici par l'apparition de viscosité dans le tube. Ajouter une solution 25 %SDS jusqu'à
une concentration finale de 2% SDS. Incuber à 60°C pendant 10 mn pour inactiver les
DNases. Additionner le chlorure de sodium jusqu'à une concentration finale égale à lM.
-Extraction au chloroforme
Additionner un volume de chloroforme, agiter doucement pendant 10 à 15 mn et
centrifuger à 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis récupérer la phase liquide. Répéter
l'extraction au chloroforme tant qu'il y a une interface visible entre les deux phases après
cent ri fugation.
-Précipitation à l'isopropanol
Ajouter 119 volume de la solution d'acétate de sodium-EDTA et 2,5 volumes
d'isopropanol. Agiter lentement jusqu'à apparition dans la solution d'un culot visqueux; ce
culot est fonné d'acides nucléiques, de protéines et de sels. Faire adhérer par simple
rotation ce culot au bout effilé d'une pipette stérile. Dissoudre à nouveau le culot dans
une solution O,IM de citrate trisodique Additionner une solution de citrate trisodique 20
fois concentrée jusqu'à obtention d'une concentration finale égale à une fois citrate
trisodique. Additionner du NaCl jusqu'à une concentration finale en NaCI égale à lM.
-Purification enzymatique
Ajouter une sol ution de RNase jusqu'à une concentration égale à 10 mg/ml de RNase et
incuber 30 mn à 37°. Ajouter la solution de protéinase K jusqu'à une concentration égale à
50 mg/ml et la solution de SDS jusqu'à une concentration égale à 1% et incuber pendant 1
heure à 37°C. Extraire J'ADN avec 1 volume de chloroforme et précipiter la phase
supérieure avec de ]'isopropanol comme précédemment. Récupérer l'ADN comme
précédemment et Suspendre le culot obtenu dans de la solution T.E. ou dans de l'eau
bidistillée stérile.
6.1.4 Extraction d'ADN plasmidique
6.1.4.1 Extraction ra pide (l Frère, 1991 )
Les réactifs:
Solution I :
Solution II :
Solution III :
Phénol 1chloroforme 1Alcool isoamylique (voir 6.1.1)
Solution TE :
Mode opératoire:
10mM EDTA+50mM Tris, pH7,5+100flg/l RNase A
0,2 M NaOH +1 % SDS
2,55 M Acétate de potassium, pH 4,8.
(voir 6.1.1)
Centrifuger 10 ml de culture et récupérer le culot dans 300 III de solution l refroidie.
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