THS-6596.pdf

pendant 5 mn à température ambiante et récupérer la phase liquide. Additionner à la phase
liquide récupérée 1/9 volume d'acétate de sodium et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à _
20°C, mélanger doucement et brièvement et laisser précipiter pendant une heure au
minimum à -20°C. Centrifuger 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis éliminer la phase
liquide. Décanter le résidu avec 1 ml d'éthanol 70%. Centrifuger à 12000 g pendant 5 mn
à 4°C puis éliminer la phase liquide. Suspendre dans 100 ml d'eau bidistillée stérile ou de
solution T.E..
6.1.3 Extraction et purification d'ADN (Marmur et al. ,1961, modifié)
Les réactifs:
Chloroforme:
Solution de citrate trisodique 20 X SSC :
Sol ution de tampon tris-EDTA : (voir 6.1.1)
Solution de lysozyme: (voir 6.1.1)
Solution de mutanolysine : (voir 6.1.1)
Solution SDS : (voir 6.1.1)
Solution de chlorure de sodium: (voir 6.1.1)
Chisome: (voir 6.1.])
Solution d'acétate de sodium-EDTA :
Solution de Ribonucléase A :
Solution de Protéinase K :
Solution TE: (voir 6.1.1)
Isopropanol:
70 % Isopropanol :
Mode opératoire:
-Lyse et séparation des constituants cellulaires.
3 M Nacl +0,3 M citrate de sodium, pH 7,0
3 M Acétate de sodium 0,01 M EDTA, pH 7,0
0,5 mg/ml RNase dans 2 x SSC, pH, 7,5 ; faire
chauffer à lOO°C pendant 10 mn inactiver les
DNase.
1°mg/ml Protéinase K
Centrifuger 1 litre de culture à 5000 g pendant 30 mn et à température ambiante.
Suspendre les sédiments dans une solution de tampon EDTA (10 ml /g de sédiment) et
laisser refroidir à -20°C pendant 1 heure minimum. Ajouter la solution de lysozyme (10
Ill/ml de suspension cellulaire). Ajouter la solution de mutanolysine (lill/ml de suspension
cellulaire). Incuber pendant 10 à 60 mn à 37°C, sous agitation. La lyse des cellules se
./
./
25