THS-6596.pdf
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pendant 5 mn à température ambiante et récupérer la phase liquide. Additionner à la phase<br />
liquide récupérée 1/9 volume d'acétate de sodium et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à _<br />
20°C, mélanger doucement et brièvement et laisser précipiter pendant une heure au<br />
minimum à -20°C. Centrifuger 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis éliminer la phase<br />
liquide. Décanter le résidu avec 1 ml d'éthanol 70%. Centrifuger à 12000 g pendant 5 mn<br />
à 4°C puis éliminer la phase liquide. Suspendre dans 100 ml d'eau bidistillée stérile ou de<br />
solution T.E..<br />
6.1.3 Extraction et purification d'ADN (Marmur et al. ,1961, modifié)<br />
Les réactifs:<br />
Chloroforme:<br />
Solution de citrate trisodique 20 X SSC :<br />
Sol ution de tampon tris-EDTA : (voir 6.1.1)<br />
Solution de lysozyme: (voir 6.1.1)<br />
Solution de mutanolysine : (voir 6.1.1)<br />
Solution SDS : (voir 6.1.1)<br />
Solution de chlorure de sodium: (voir 6.1.1)<br />
Chisome: (voir 6.1.])<br />
Solution d'acétate de sodium-EDTA :<br />
Solution de Ribonucléase A :<br />
Solution de Protéinase K :<br />
Solution TE: (voir 6.1.1)<br />
Isopropanol:<br />
70 % Isopropanol :<br />
Mode opératoire:<br />
-Lyse et séparation des constituants cellulaires.<br />
3 M Nacl +0,3 M citrate de sodium, pH 7,0<br />
3 M Acétate de sodium 0,01 M EDTA, pH 7,0<br />
0,5 mg/ml RNase dans 2 x SSC, pH, 7,5 ; faire<br />
chauffer à lOO°C pendant 10 mn inactiver les<br />
DNase.<br />
1°mg/ml Protéinase K<br />
Centrifuger 1 litre de culture à 5000 g pendant 30 mn et à température ambiante.<br />
Suspendre les sédiments dans une solution de tampon EDTA (10 ml /g de sédiment) et<br />
laisser refroidir à -20°C pendant 1 heure minimum. Ajouter la solution de lysozyme (10<br />
Ill/ml de suspension cellulaire). Ajouter la solution de mutanolysine (lill/ml de suspension<br />
cellulaire). Incuber pendant 10 à 60 mn à 37°C, sous agitation. La lyse des cellules se<br />
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