THS-6596.pdf

-Séparation de l'ADN des autres constituants cellulaires:
Additionner 33 ml de solution de cWorure de sodium, puis incuber 1 heure au minimum
dans de la glace, centrifuger à 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis récupérer la phase
supérieure dans un nouveau tube Eppendorf Ajouter 1 volume de chisome, homogénéiser,
centnfuger à 12000 g pendant 5 mn à 4°C puis récupérer la phase liquide dans un nouveau
Eppendorf
-Précipitation par l'éthanol:
Ajouter 1/9 volume d'acétate de sodium et 2,5 volumes d'éthanol absolu. Incuber ensuite à
-20°C pendant 30 mn puis centrifuger à 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis éliminer la
phase liquide et faire sédimenter les résidus contenant les acides nucléiques avec 1 ml
d'une solution de 70% d'éthanol préalablement refroidie. Laver le culot avec de l'éthanol et
sécher sous vide.
-Purification enzymatique:
Au culot séché et Javé, ajouter 100 ml d'une solution T.E. contenant 10 mg/ml de RNase et
incuber 30 mn à 37° Ajouter 1 ml de la solution de protéinase K et incuber pendant 1
heure à 37°C. Extraire J'ADN avec 1 volume de chisome. Précipiter avec l'éthanol comme
précédemment. Suspendre le culot obtenu dans de la solution T.E. ou de l'eau bidistillée
stérile.
6.1.2 Extraction rapide d'ADN /ARN (Stahl el al. , 1987, modifié)
Les réactifs:
Solution TE: (voir 6.1.1)
Solution SDS : (voir 6.1.1)
Chisome: (voir 6.1.1)
Phénol / Chisome :
Solution d'acétate de sodium:
Mode opératoire:
(1/1) (VN)
3 M, pH 7,0
A partir d'une culture jeune de 12 à 18 heures. Centrifuger 10 ml de culture 5000 trs/mn,
4°C, pendant 15 mn. Laver les sédiments avec 1 ml de solution T.E. Suspendre les
sédiments dans 400 III de solution TE dans un microtube (Sarstedt, Rommelsdorf. Ajouter:
50 III SDS + 400 III de billes de verre stériles (0,17- 0,18 mm ; Braun, Melsungen) + 400
III de phénoUChisome. Bien mélanger puis casser les cellules à l'aide d'un bain à ultrason
(Banelin Sonorex TK 52 Transistor, Bachhofer, Reutligen) ; la durée de cette opération ne
doit pas excéder 2 mn. Incuber le mélange à 65°C pendant 10 mn puis centrifuger 12000 g
pendant 15 mIl à température ambiante. Prélever à l'aide d'une pipette le surnageant
contenant les acides nucléiques dans un tube Eppendorf stérile. Addition d'un volume de
chisome. Agiter pendant 5 mn pour mélanger les deux phases. Centrifuger à 12000 g
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