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6. EXTRACTION ET PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES
6.1 Extraction d'acides nucléiques chez les bactéries
6.1.1 Extraction et purification d'ADN chromosomique (Lev.;ington el al. ,1987)
Les réactifs:
Solution de tampon trls-EDTA
Solution de lysozyme:
Solution de mutanolysine :
Solution SOS:
Solution de chlorure de sodium:
Chisome:
SOmM Tris!HCl +SOmM NaCI +10mM EDTA, pH 8,0
10 mg/ml lysozyme dans SO mM de tris!HCI
SOOO unités / ml mutanolysine dans 0,1 M de solution
phosphate de sodium, pH 6,2.
2S % SOS dans l'eau distillée
S MNaCl
Solution acétate de sodium-EDTA: 3 M Acétate de sodium
0,01 M EDTA, pH 7,0
Solution de Ribonucléase A :
Solution de Protéinase K :
Solution TE
Ethanol absolu:
70 % Ethanol:
Mode opératoire:
Chlorofonne / Alcool isoamyl igue (24/1) (v/v)
O,S mg/ml RNase dans 2 x SSC , pH, 7,S ; faire chauffer
à iOO°C pendant 10 mn pour activer les DNase.
JO mg/ml Protéinase K (Boeringer-Mannheim)
Tris 10 mM + EDTA 1 mM, pH 8,0
Prélever 1ml d'une culture de 12 à 18 heures. Centrifuger à 12000 g pendant S mn à
température ambiante. Laver les résidus avec 1 ml de solution TTE puis resuspendre dans
100 ml de TTE.
-Lyse des cellules:
Ajouter lS ml de solution de lysozyme et 1 ml de mutanolysine et incuber à 37°C pendant
lS à 30 mn (environ lS mn pour E. coli et 30 mn pour certaines bactéries gram positif).
Ajouter 40 ml de solution SDS pour optimiser la lyse. Incuber à -6SoC (inactivation des
DNase). Agiter au vortex pendant S mn pour séparer l'ADN des autres constituants
cellulaires.
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