THS-6596.pdf
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6. EXTRACTION ET PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES<br />
6.1 Extraction d'acides nucléiques chez les bactéries<br />
6.1.1 Extraction et purification d'ADN chromosomique (Lev.;ington el al. ,1987)<br />
Les réactifs:<br />
Solution de tampon trls-EDTA<br />
Solution de lysozyme:<br />
Solution de mutanolysine :<br />
Solution SOS:<br />
Solution de chlorure de sodium:<br />
Chisome:<br />
SOmM Tris!HCl +SOmM NaCI +10mM EDTA, pH 8,0<br />
10 mg/ml lysozyme dans SO mM de tris!HCI<br />
SOOO unités / ml mutanolysine dans 0,1 M de solution<br />
phosphate de sodium, pH 6,2.<br />
2S % SOS dans l'eau distillée<br />
S MNaCl<br />
Solution acétate de sodium-EDTA: 3 M Acétate de sodium<br />
0,01 M EDTA, pH 7,0<br />
Solution de Ribonucléase A :<br />
Solution de Protéinase K :<br />
Solution TE<br />
Ethanol absolu:<br />
70 % Ethanol:<br />
Mode opératoire:<br />
Chlorofonne / Alcool isoamyl igue (24/1) (v/v)<br />
O,S mg/ml RNase dans 2 x SSC , pH, 7,S ; faire chauffer<br />
à iOO°C pendant 10 mn pour activer les DNase.<br />
JO mg/ml Protéinase K (Boeringer-Mannheim)<br />
Tris 10 mM + EDTA 1 mM, pH 8,0<br />
Prélever 1ml d'une culture de 12 à 18 heures. Centrifuger à 12000 g pendant S mn à<br />
température ambiante. Laver les résidus avec 1 ml de solution TTE puis resuspendre dans<br />
100 ml de TTE.<br />
-Lyse des cellules:<br />
Ajouter lS ml de solution de lysozyme et 1 ml de mutanolysine et incuber à 37°C pendant<br />
lS à 30 mn (environ lS mn pour E. coli et 30 mn pour certaines bactéries gram positif).<br />
Ajouter 40 ml de solution SDS pour optimiser la lyse. Incuber à -6SoC (inactivation des<br />
DNase). Agiter au vortex pendant S mn pour séparer l'ADN des autres constituants<br />
cellulaires.<br />
/<br />
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