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5.2.2 Auxanogramme L'utilisation de certaines substances comme unique source de carbone ou d'azote sera étudiée sur milieux solides. Ces milieux sont inoculés avec 100 III d'une suspension obtenue à partir d'une culture de 24 heures (2 anses de culture dans 1 ml d'eau distillée stérile). La suspension est étalée à l'aide d'une pipette coudée stérile. Puis on dépose en cercle à la surface de la gélose les disques. II s'agit de disques de 0,6 cm de diamètre, imprégnés de 2 gouttes d'une solution à 20 % de la substance à étudier. L'incubation est faite à 30°C, en aérobiose. La lecture est effectuée 24 à 48 heures après l'ensemencement. La présence d'une zone de croissance autour du disque est considérée comme un résultat positif Sources de carbone Pour les sources de carbone les quinze substances suivantes sont testées : maltose, raffinose, galactose, cellobiose, tréhalose, D-mannitol, érythritol, inositol, mélibiose, Dxylose, L-arabinitol, 2-céto-D-gluconate, DL-lactate, D-glucuronate et citrate. On dispose donc 5 substances par boîte de petri. Le milieu de base est le milieu azote base-agar (Difco) qui renferme 5 g/l de sulfate d'ammonium comme source d'azote, les vitamines, les acides aminés, et les sels minéraux nécessaires. Sources d'azote Pour les sources d'azote on s'intéressera au nitrate et à la cadavérine. Le milieu de base est le milieu carbone base-agar (Difco) contenant vitamines, acides aminés, sels minéraux nécessaires et 20 gli de glucose. 5.2.3 Fermentation du glucose Le pouvoir fermentaire est mis en évidence par la production de gaz dans un tube à essai contenant une cloche Durham renversée dans un bouillon composé d'une solution de glucose 2% et d'une solution à 1% d'extrait de levure. Le bouillon est inoculé avec une culture âgée de 24 heures maximum incubé à 28°C. La lecture est effectuée 1 jour à 3 semaines après l'ensemencement. La fermentation du glucose se traduit par une production de gaz qui s'accumule dans la cloche renversée. 5.2.4 Résistance à la cycloheximide La résistance à la cycloheximide est testée sur bouillon carbone base contenant seulement 0,5% de glucose. On testera la croissance avec 0,01% et 1% de cycloheximide. Le résultat ne sera considéré comme négatif que s'il n y a pas de croissance au bout de 7 jours d'incubation à 30°C. 5.2.5 Résistance à l'acide acétique La résistance à l'acide acétique est testée sur milieu PEG-agar contenant 1% d'acide acétique. La lecture du résultat se fera après 6 jours d'incubation à 30°C. 21
5.2.6 Croissance sur PEG à 60% glucose Cette expérience se fait sur gélose PEG en pente. La gélose est incubée avec une culture de 24 heures et incubée à 28°C. L'absence de croissance au bout de deux semaines traduit un résultat négatif. 5.2.7 Confection d'arbres phylogénétiques à partir de l'analyse FTIR Le spectrophotomètre utilisé est lié à un système d'analyse de données basé sur l'analyse statistique multivariable. Il permet de dresser des arbres phylogénétiques pour les levures en se basant, surtout, sur la zone d'absorption des acides gras qui composent les lipides membranaires. Technique Les différentes souches de levure sont cultivées sur milieu PEG-agar à 30°C jusqu'à la phase exponentielle de croissance. Les cellules sont récoltées par centrifugation, lavées et séchées sous vide avant d'être mise dans une solution de KEr pour l'analyse. L'appareil utilisé est un FTIR-spectrophotomètre IFS 66. ./ 22
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Collins, M.D., Rodrigues D., Ash c.
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