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5. ETUDE DES CARACTERES BIOCHIMIQUES 5.1 Caractères biochimiques des bactéries 5.1.1 Coloration de Gram et lyse par le KOn -Coloration de Gram La Coloration de Gram est basée sur la résistance des parois bactériennes, ce qui se traduit chez les souches colorées au violet cristal à résister diffèrentiellement à la décoloration par l'alcool. Elle se fait sur des cultures de 12 à 24 heures. Solutions colorantes utilisées -Solution de violet cristal: Solution A (Violet cristal 2 g +Ethanol 96%) +Solution B (Oxalate d'ammonium O,Sg + eau distillée 80 ml). -Solution de safranine : (Safranine 0,25 g +Ethanol 10 ml +Eau distillée 90 ml) -Solution iodo-iodurée : (Lugo!) Technique Faire sécher une mince préparation sur une lame. Fixer rapidement à la flamme. Recouvrir de violet cristal, laisser agir 15 secondes. Rincer deux fois pendant 15 secondes avec le lugol. Décolorer aussitôt à l'éthanol jusqu'à ce que l'éthanol n'entraîne plus de colorant. Laver rapidement à l'eau courante. Recolorer avec la safranine diluée pendant 15 secondes. Rincer abondamment, sécher et observer à l'immersion. -Lyse par le KOlI Ce test est basé sur la résistance de la paroi. Les souches gram négatif montrent une lyse rapide en présence de KOH. ri est pratiqué sur des cultures en phase exponentielle sur MRS-agar. Sur une lame porte-objet on mélange une colonie avec une goutte de solution 3% KOH. Au bout de 5 à 1°secondes, il se produit une lyse chez les souches Gram négatives, ce qui se traduit par J'apparition sur la lame de matériels intracellulaires gluants. Ce test n'est pratiqué que pour confirmer un résultat de la coloration de Gram. 5.1.2 Test de la catalase Ce test permet la mise en évidence de la catalase. Cette enzyme est généralement absente chez les bactéries anaérobies strictes. Technique: On effectue directement une émulsion à l'aide d'une pipette pasteur de culture bactérienne jeune dans 3 gouttes d'une solution 3 % d'eau oxygénée, la présence de catalase se traduit par l'apparition de bulles de gaz. S'il n'y a pas de dégagement gazeux au bout de 15 secondes la réaction est négative. ,/ 19
5.1.3 Production de gaz La production de gaz est étudiée sur MRS-bouillon sans extrait de viande et avec 2,5 % de maltose. Un tube à essai contenant une cloche de Durham renversée et la ml de milieu de culture est ensemencé avec la souche à étudier. La présence de bulles dans le tube renversé, après incubation indique une production de gaz (Gaz +). 5.1.4 Fermentation des hydrates de carbone Le pouvoir fermentaÎre sera étudié sur les hydrates de carbone suivants: L(+)arabinose, gl uconate de sodi um, D(-)fructose, D(+)gl ucose, D(-)mannose, lactose, mélibiose, maltose, saccharose, tréhalose, mélézitose, raffinose, esculine, D-salicine, p-arbutine, D(+)galactose, D(-)Mannitol, sorbitol, D(-)ribose, D(+)xylose, N-acétyl-D-glucosamine, amygdaline et celJobiose. Pour chaque sucre, on réalise une solution 2%. Toutes ces solutions seront filtrées exceptée la solution d'esculine qui sera autoclavée à 121°C pendant 10 mn. Les tests se feront sur plaques pour microtitration (cupule en U), Chaque cupule recevra 100 III de solution d'hydrate de carbone, 40 III de paraffine stérile et 40 III d'urle suspension de la souche à étudier dans le milieu de culture prévu pour ce test (voir composition du milieu pour étude du pouvoir fermentaire). Les plaques ainsi remplies sont incubées à 30°C, la lecture se fait jusqu'au sixième jour incubation. 5.1.5 Activité amylolytique La fermentation de l'amidon est étudiée sur un milieu solide en boîte de petri contenant 3 g d'amidon soluble. Après 48 heures d'incubation, on recouvre la surface de la culture par une solution de lugol. Une réaction positive (amylase +) se traduit par une zone claire autour des colonies, le reste de la boite étant violet. Pour la détection des recombinants E.coli (amy+), vu le nombre impol1ant de souches à tester, on fait la culture dans le même milieu mais en présence de bromocrésoJ pourpre, ce qui permet de déceler, par le virage du bleu au jaune, les recombinants amylase positif. 5.1.6 Production de bactériocine Ensemencer le milieu BSM-agar en déposant en surface 1111 d'une culture de 16 heures de la souche à étudier. Après séchage, on incube la culture à 25°C pendant 24 heures dans des conditions de microaérophilie, puis on recouvre la surface de la boîte de petri avec 140 ml de culture de la souche test. On incube encore pendant 16 à 20 heures dans les mêmes conditions. S'il y a production de bactériocine active sur la souche indicatrice, il se fonne une zone d'inhibition autour de la zone de croissance de la souche productrice. 5.2 Caractères biochimiques des levures 5.2.1 Hydrolyse de l'urée Un bouillon contenant de l'urée (2%) est ensemencé avec une préculture de la souche à tester et incubé à 37°C. Ce bouillon est mauve à l'état frais, l'hydrolyse de l'urée se traduit par une a1calinisation du milieu qui prend une teinte rosée puis rouge dans une durée qui ne dépasse pas 4 heures. ./ 20
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Les « non lactiques» Paenibacillu
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Collins, M.D., Rodrigues D., Ash c.
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Martinez Murcia A. J., and Collins
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