THS-6596.pdf

A
ADN
Amy
Amy+
Amp
AP
ARN
ARNr
ATP
B
Bac.cereus
bp
BSM
C
CI
dATP
dCTP
dNTP
dTTP
dUTP
ddATP
ddCTP
ddNTP
ddTTP
ddUTP
DNase
DIG
DSM
E. coli
FST
EPS
ESP
FTIR
9
h
GC
Gluco.oxy
GRAS
Hel.vires
HIV
ITA
kb
Lac.brev
Lac.cas
. Lac.cas.rh
Lac.cur
LISTE D'ACRONYMES
Adénine
Acide désoxyribonucléique
Amylase
Amylase positive
Ampicilline
Phosphatase alcaline
Acide ribonucléique
Acide ribonucléique ribosomial
Adénosine -triphosphate
Bacillus
Bacillus cereus
Bases paires
Milieu pour détecter la production de bactériocine
(Bacteriocin Screening Medium)
Cytosine
Clostridium
Désoxyadénosine -triphosphate
Désoxycitosine-triphosphate
Désoxynucléotide-triphosphate
Désoxythymidine-triphosphate
Désoxyuridine-triphosphate
Di-désoxyadénosine-triphosphate
Di-désoxycitosine-triphosphate
Di-désoxynucléotide-triphosphate
Di-désoxythymidine-triphosphate
Di-désoxyuridine-triphosphate
Désoxyribonucléases
Digoxigénine
Collection Allemande de Micro-organismes
(Deutsch Sammlung fuer Mikroorgnismen)
Escherichia coli
Faculté des Sciences et Techniques
Exopolysaccharide
Ecole Supérieure Polytechnique
Fourrier Transform Infrared Spectroscopy
Accélération de la pesanteur
Heure
Pourcentage guanine +cytosine de l'ADN
Gluconobacter suboxydans
Organismes sans danger
(Generally regarded as safe)
Heliothrix virescens
Virus de l'immunodéficience Humain
Institut de Technologie Alimentaire
Kilobase
Lactobaci/lus brevis
Lactobacillus casei
Lactobaci/lus casei subs.rhamnosus
Lactobacillus curvatus
/ /

,/
Lac.Ferm
Lac minor
Lac.plant
Lac.sake
LaUarci
Lat.plant
LB
Lb
Lb a
Lb b
Lb fe
Lb fr
Lbl
Lb pe
Lb po
Lb pl
Lb s
Leuc.ameli
Leuc.carno
Leuc.citreu
Leuc. fallax
Leuc.fructo
Leuc.gelid
Leuc.lact
Leuc.mes
Leuc.pseud
LTH
m
mA
Mbp
mn
MRS
N
NBB
NBT
ng
nm
Geno.oenos
pmol
PA
Pae.macer
PCR
PED
Ped.Acidi
Ped.damn
Ped pard
Ped.pento
RNase
S
S.
SA-AP
Lactobacillus fermentum
Weissella minor(Lactobacillus minor)
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus sake
Lactobacillus farcimini
Lactococcus plantarum
Lura bouillon
Lactobacillus
Lactobacillus amylovorus
Laetobaeillus brevis
Lactobaeillus fermentum
Lactobaeillus fruetuvorens
Laetobaeillus lindneri
Laetobaeillus pentosus
Laetobaeillus pontis
Laetobaeillus plantarum
Lactobaeillus sake
Leueonostoe amelibiosum
Leueonostoc carnosum
Leueonostoe citreum
Leueonostoe fallax
Leueonostoe fruetosus(Laetobacillus fruetosus)
Leueonostoe gelideum
Leueonostoe laetis
Leueonostoc mesenteroides
Leueonostoe pseudomesenteroides
Lehrstuhl für technische mikrobiologie
milli
mill Ampère
Mille bases paires
minute
Milieu de De Man Rogosa et Sharp
Nucleotude
Bouillon nutritif de Back
(Nutrent broth of Back)
Chlorure de tétrazolium+ Nitrobleu
Nanogramme
namomètre
Oenoeoceus oenos (ex Leueonostoe oenos)
Picomole
Phosphatase alcaline
Paenibaeillus macerans
(Polymerase Chain Reaction)
Peptone extrait de levure dextrine
Pediococcus aeidilactiei
Pediococcus damnosus
Pediococcus pardalus
Pediococcus pentosaceus
Rubonucléase
Coefficient de sédimentation
Staphylococcus
Streptavidine-Phosphatase alcaline
,/

./
sos
SSC
STE
Str
Staph.sapr
Staph.sciur
Sporol.dex
T
T7
TAE
Taq
TBE
TE
TEX
Therm.amy
trs
TTE
UFC
UV
V
Wei.Conf
Wei.halot
Wei.helli
Wei.Kand
Wei.para
Wei.param
Wei.viri
X-Phosphate
Sodium dodécyl sulfate
standard saline de soduim
Saccharose tris-EDTA
Streptococcus
Staphy/ococcus saprophyficus
Staphy/ococcus sciurus
Sporo/acfobacillus dextranicus
Thymine
virus bactériophage T7
Tris acide acétique EDTA
Thermus aquaticus
Tris acide borique EDTA
Tris-EDTA
Trypton-Extrait de levure
Thermobacillus amy/o/yficus
Tours
Tampon-tris-EOTA
Unité formant une colonie
ultraviolet
volume
Weissella confusa
Weissella ha/oto/erant
Weissella hellenica
Weissella kand/eri
Weissella paramesenteroides
Weissella paramesenteroides
Weissella viridiscens
-S-Brome-4-ch lor-3-lndolyl-Phosphate
,
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,/
INTRODUCTION
/'

Plusieurs millénaires avant notre ère les hommes utilisaient déjà des fermentations pour
produire et pour conserver des aliments. Mais la nature exacte des substrats, les organismes et
les fonctions biologiques relatifs à ces phénomènes ont commencé à être élucidés seulement
avec Louis Pasteur à partir du xrx éme siècle. Avec les progrès des sciences telles que la
Biologie et la Chimie au cours du XX éme siècle et l'essor considérable des techniques de
biologie moléculaire ces dernières années, on s'est aperçu qu'avec l'étude des écosystèmes
fermentaires l'Homme pouvait détenir des outils biologiques exploitables dans des domaines
différents tels les bio-industries et la médecine (probiotique).
Ces bio-industries ont un intérêt multiple. Elles utilisent surtout des procédés
biotechnologiques qui ont l'avantage d'être mieux adaptés à la nature. Les fonctions
biologiques utilisées sont aussi caractérisées par leur très grande richesse dans la nature et
leur spécificité remarquable. Ce qui permet d'envisager une diversification des produits et
une optimisation des procédés.
Le contexté mondial actuel marqué par l'accroissement et la diversification des besoins
des populations de plus en plus nombreuses, par la raréfaction des matières premières et par
un degré de pollution inquiétant a largement favorisé les recherches et l'utilisation de moyens
de production biologiques. Cependant J'utilisation des procédés bioteclmologiques nécessite,
comme préalable, un inventaire des fonctions disponibles et aussi une connaissance
approfondie de la nature de ces fonctions.
Ainsi cette étude s'inscrit dans un programme d'évaluation et de caractérisation d'outils
biotechnologiques au Sénégal . Elle se propose de faire un large inventaire des organismes
intervenant dans la fermentation de la sève du palmier à huile Eleais guineensis.
Il faut noter que la fermentation de la sève de palmier est réalisée traditionnellement
dans différentes régions du monde (Afrique de J' ouest, Asie) essentiellement pour produire
du vin de palme qui est une boisson alcoolisée. Avec la fermentation de la sève du palmier il
est possible de produire du vinaigre de qualité ou de l'alcool ou de l'acide lactique.
Toutes les études précédentes ont mentionné la présence dans le vin de palme de
bactéries lactiques et de levures appartenant surtout aux genres Saccharomyces et
Schizosaccharomyces. Nous nous proposons dans cette étude de faire une identification plus
poussée d'autant plus que les recherches suscitées par l'intérêt pratique et l'élargissement des
champs d'investigations dans le monde microbiologique ont multiplié les découvertes
d'espèces. Dès lors une étude se basant exclusivement sur les traits morphologiques et sur les
caractères physiologiques est rendue extrêmement difficile par le nombre considérable de
tests à effectuer pour caractériser des espèces génétiquement différentes mais pouvant être
phénotypiquement proches du fait de l'adaptation à un même écosystème. Ceci nous amène à
combiner les méthodes classiques aux nouvelles techniques de biologie moléculaire dans
cette étude.
Nous utiliserons donc l'amplification avec la PCR, l'analyse des spectres FTIR, les
sondes génétiques et surtout l'analyse des séquences de gènes d'ARNr 16S pour caractériser
nos espèces.
/ /
1

Nous chercherons également à dégager une démarche concrète faisant appel à la fois
aux caractères morphologiques, physiologiques et génétiques pour identifier différentes
espèces microbiennes et mettre en évidence chez ces micro-organismes quelques
caractéristiques intéressantes telles que le spectre fermentaire, les productions
d'exopolysacharides, de bactériocine et d'amylases.
Enfin nous chercherons à isoler un gène d'amylase par la création de recombinants E.
coli (amy+) par clonage.
Le but d'une telle étude est donc de détenir des informations nécessaires pour une
éventuelle utilisation des fonctions biologiques des micro-organismes de ces écosystèmes.
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2

'
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
/'

conservation de ces aliments: c'est le cas de Pediococcus damnosus. Ces micro-organismes
peuvent également provoquerla formation de diacétyl dans la bière.
Le genre Leuconostoc renferme aussi des espèces capables de se développer à la
surface des viandes réfrigérées ou elles peuvent constituer, à une température de 1 à 2 oC,
100% de la microflore. Elles provoquent souvent une décoloration et une perte d'odeur et de
goût de ces viandes lorsqu'elles atteignent une concentration supérieure à 10 8 par cm 2 . De
nouvelles espèces de Leuconostoc citreum et Leuconostoc pseudomesenteriodes résistantes à
la vancomycine ont été récemment isolées de sources cliniques (méningites purulentes ou
infections odontogènes) sans que leur pouvoir pathogène ne puisse être réellement établie.
Le groupe des Streptococcus hémolytiques est étroitement parasite d'hommes ou
d'animaux. L'aptitude des Streptococcus orales à coloniser la surface bucco-dentaire et leur
production d'acide sont à la base des caries.
Beaucoup de souches d'Enterococcus faecalis peuvent être et sont capables de
provoquer, à elles seules ou en association avec d'autres micro-organismes, des endocardites
et des infections urinaires ou intra-abdominales.
Le genre Carnobacterium est connu exclusivement pour la détérioration de viandes
conservées (Hammes et al. , 1990). Certaines souches de Carnobacterium piscicola sont
pathogènes chez les poissons (Cone, 1982).
Selon certains auteurs Lactococcus garviae serait à l'origine de mastitis chez les vaches
laitières. Mais de telles présomptions sont, pour beaucoup d'auteurs, injustifiées.
Malgré ces quelques aspects négatifs, la plupart des bactéries lactiques sont considérées
comme des organismes utiles et sans danger ou GRAS «Generally Regarded as Safe ».
Quelques caractéristiques recherchées les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques présentent une multitude de caractères intéressants tels que la
production de bactériocine, d'enzymes, d'exopolysaccharides et de substances dites
secondaires acides organiques, alcool, acétaldehydes, diacétyles.
Production de bactériocines
Une activité antimicrobienne a été mise en évidence chez des bactéries lactiques
(Hammes et al., 1990; Lindgren et al., 1990; Tichaczek et al., 1993). Cette action lorsqu'elle
est non spécifique, avec un large spectre d'inhibition, est généralement attribuée à la
production d'acides organiques et / ou d'eau oxygénée.
Les bactériocines sont de nature peptidique et leur effet sur les espèces sensibles peut
être bactériostatique ou bactéricide (Tagg et al., 1976 Klaenhammer, 1988).
Certaines bactéries peuvent produire et sécréter des bactériocines capables d'inhiber le
développement dans les aliments de micro-organismes indésirables qui sont putréfiants ou
occasionnellement pathogènes comme Listeria monocytogenes (Tichaczek et al., 1993). Une
éventuelle application de ce dernier aspect dans la constitution de starter et dans les processus
de production et de conservation des aliments a stimulé les recherches vers la caractérisation
et la compréhension des mécanismes d'action de ces bactériocines.
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Il existe plusieurs classifications. Ces classifications s'appuient sur des critères comme
le poids moléculaire, la thermorésistance, la nature (protéique ou glucoproteique).
La nisine produite par des Lactococcus lactis est l'une des bactériocines les mieux
connues. Découverte en 1928 elle est utilisée depuis pour la conservation d'aliments. La
ni sine inhibe plusieurs bactéries Gram-positif des genres Staphylococcus, Enterococcus,
Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostocs, Listerias, Corynebacterium et Mycobaclerium
luberculosis. Elle est particulièrement active sur les spores germinatives des bacillus et des
clostridia surtout sur celles de Clostridium botulinum (Teuber et al. ,1993).
Le mécanisme d'action de la nisine et sa structure chimique ont été élucides et
récemment le gène de la nisine a été cloné et séquencé.
Production d'enzymes
Les enzymes sont à la base de toute activité bactérienne. Généralement c'est au niveau
de la production d'enzymes que se situe le besoin des industries. L'étude des enzymes est
donc d'un grand intérêt. Les enzymes ciblées peuvent être classées dans trois grandes
familles: les lipases, les enzymes du système protéolytique et celles actives sur des substrats
appartenant à la famille des gl ucides.
Les lipases
Les lipases sont présentes chez Laclobacillus curvalus, chez les staphylococcus et
micrococcus et aussi chez les levures, chez quelques espèces du genre Candida, Rhodotorula,
Hansenula, Saccharomycopsis. Ces organismes Lipolytiques peuvent aussi provoquer la
détérioration de produits finis contenant des matières grasses.
Les enzymes du système protéolytique
Les enzymes du système protéolytique des bactéries lactiques sont divisées en trois
groupes suivant leurs niveaux d'intervention dans la réaction protéolytique.
-Les proteinases
Les protéinases sont des enzymes à spécificité relativement large qui permettent de
fragmenter les protéines en peptides. La quantité de protéinases s'élève dans la première
phase de la digestion de la caséine. Une analyse des produits libérés après cette phase révèle
la présence de peptides de grandes tailles (Monnet et al. , 1986 ; Reid el al. , 1991).
-Les peptidases
Ces enzymes sont responsables de la digestion des peptides. Leur action permet aux
micro-organismes d'obtenir des oligopeptides et des acides aminés essentiels pour la
croissance et le métabolisme.
-Les systèmes de transports
Protéinases et peptidases sont libérées dans le milieu mais les substances organiques
résultantes de leur action doivent traverser la membrane cytoplasmique. Ce déplacement est
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5

assuré par des systèmes de transports qui sont indispensables pour la nutrition azotée des
bactéries lactiques.
Les micro-organismes protéolytiques jouent souvent un rôle important dans la saveur et
l'odeur des produits alimentaires. La production d'acétaldehyde à partir de protides ou
d'acide aminé (thréonine) est à l'origine du pouvoir aromatisant de certaines bactéries
thermophiles.
Enzymes actives sur les glucides
Ce sont les systèmes enzymatiques permettant aux bactéries lactiques de dégrader les
sucres pour en tirer leur énergie. Le substrat le plus communément utilisé est le glucose. Sa
dégradation fait intervenir un nombre important d'enzymes. Cependant dans les bioindustries
on recherche surtout des micro-organismes produisant des enzymes capables
d'attaquer des substrats glucidiques abondants et peu coûteux. De ce point de vue les microorganismes
amylolytiques et les cellulolytiques sont très recherchés pour la transformation de
certains déchets industriels ou agricoles.
La fermentation des biopolymères glucidiques se fait en plusieurs phases:
-Phase d'hydrolyse des polymères
-Phase fermentaire. Cette phase dépend des interactions des micro-organismes et des
conditions physico-chimiques (température, pH, aération, substrats etc.) des écosystèmes.
-La dernière phase, selon l'écosystème, peut être, par exemple, une phase acétogène ou
méthanogène...
Dans les industries fermentaires ces paramètres sont modulés en fonction des produits
finaux désirés.
Dégradation de l'amidon et autres biopolymères
La dégradation de l'amidon et d'autres polymères par voie microbiologique se fait par
différentes enzymes qui sont pour la plupal1 commercialisées (tableau 1).
Tableau 1: Exemple d'utilisations industrielles et commerciales des enzymes (Glick et al.,
1995)
Enz me
a-amylase
J3-amylase
bromolaine
cellulase
ficine
glucoamylase
glucose isomèrase
glucose oxydase
invertase
Utilisation
production de bière et d'alcool
production de maltose
tendérisation de viandes, clarification des jus de fruits
fabrication d'alcool et de glucose
tendérisation de viandes, clarification des jus de fruits
production de bière et d'alcool
fabrication de sirop avec une forte teneur en fructose
agent antioxydant et conservant
h drol se de sucre brut
Les gènes responsables de la production d'amylase se trouvent en plusieurs copies dans
le génome bactérien et peuvent être compris dans des plasmides. En comparant les séquences
des gènes d'amylase issues de différents êtres vivants on remarque qu'il existe souvent des
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6

égions conservées durant l'évolution. Ce caractère est utilisé pour l'isolement de ces gènes
par PCR. ..
Production d'exopolysaccharide
La production d'exopolysaccharide a été notée chez plusieurs bactéries (Cerning et al.,
1988; Ceming et al., 1990). Ces exopolysaccharides sont soit excrétés dans le milieu de
croissance soit ils restent collés à la paroi bactérienne formant ainsi un complexe appelé
exopolysaccharide capsulaire. Certains exopolysaccharides ont un pouvoir texturant qui leur
permet de participer au maintien de la viscosité des produits dans lesquels ils sont présents.
Ces exopolysaccharides sont généralement utilisés comme gélifiant en cosmétique et en
chirurgie et dans les produits alimentaires.
Dans les yaourts la présence d'exopolysaccharide permet de minimiser les risques de
synérèses. Les recherches des exopolysaccharides se sont focalisées d'abord sur les genres
Xanthomonas campestris (gomme xanthane), Rhyzobium spp, Klebsiella spp., Pseudomonas
spp. ,Acetobacter spp. et E. coli. (Sutherland., 1972; Sutherland., 1990; Whitfield., 1988).
La composition des Exopolysaccharides
La composition des exopolysaccharides est très variable. L'analyse d'un
exopolysaccharide chez Streptococcus thermophilus révèle la présence de galactose et
glucose et d'un faible taux de pentose (Cerning et al., 1988; Cerning et al., 1991; Doco et al.,
1990; Oela et al., 1983; Schellhaas.,1983). On trouve,aussi, essentiellement du glucose et du
galactose dans l'exopolysaccharide sécrété par une souche de Lactococcus lactis sp. lactis.
Chez Lactobacillus sake 01 l'analyse de la composition de l'exopolysaccharide formé révèle
la présence de glucose et de rhamnose dans les proportions 3:2 (Van den Berg et al., 1995).
Chez Lactobacillus bulgaricus le glucose et le rhamnose sont les constituants essentiels de
l'exopolysaccharide qui renferme aussi en proportion beaucoup plus faible du mannose et de
l'arabinose.
Propriétés probiotiques des bactéries
Les bactéries les plus citées pour leurs effets probiotiques sont les Lactobacillus
responsables au niveau des intestins d'une déconjugaison des sucs biliaires qui aboutit à la
précipitation des cholestérols. Cet effet hypocholestérolémiant diminue le risque de maladies
cardio-vasculaires. Lactobacillus delbrueckui ssp bulgaricus et Bifidobacterium peuvent aussi
avoir des effets probiotiques (Salminen et al., 1996). Les bactéries lactiques de certains
produits laitiers comme le yaourt jouent un rôle dans le maintien de l'équilibre de la
microflore intestinale et dans la protection contre les infections intestinales (propriété
antagoniste des bactériocines et des acides organiques). Certaines bactéries lactiques
participent à la digestion du lactose
Utilisation comme starters
Dans une fermentation industrielle il est nécessaire pour avoir des produits standards
d'utiliser des micro-organismes sélectionnés permettant l'initiation et un contrôle optimal des
procédés, d'accélérer le processus et d'éviter les contaminants. C'est dans ce but que sont
fabriqués et utilisés des starters. Les starters microbiens sont souvent des cultures mixtes qui
peuvent renfermer des bactéries des levures et des champignons au sens strict.
/
7

Les critères pour le choix d'un starter
Un bon starter doit contenir des micro-organismes facilement cultivables sans aucun
pouvoir pathogène et exerçant une activité inhibitrice sur le développemen; des microorganismes
qui peuvent nuire à la qualité du produit. Les starters doivent aussi avoir un effet
dans l'élaboration des caractéristiques organoleptiques (texture, apparence, saveur etc.)
Les micro-organismes composant un starter sont souvent sélectionnés à partir de la
flore qui prédomine dans les fermentations naturelles.
Tableau 2 : Quelques starter utilisés dans les industries alimentaires (Teuber et al.,
1987 modifié.
Industries demandeurs Starters Utilisations
Industries laitières
Yaourt:
Industries fromagères
Pannesan:
Charcuteries
Vins
Optimisation des souches
Lactobacillus delbrueckii Arômes, acidification
Streptococcus thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
Streptococcus salivarus
Streptococcus thermophilus
Pediococcus
Levures sélectionnées
Leuconostoc oenos
Arômes, activités enzymatiques
Production d'acide lactique
Arômes et production d'alcool
Fermentation malolacti ue
Il est nécessaire parfois d'améliorer les capacités de production ou de résistance (aux
bactériophages) d'une souche de micro-organisme donnée en vue de son utilisation. Dans ce
but on fait appel à des techniques de génie génétique. En effet, grâce aux techniques de
clonages et de recombinaisons il est possible d'implanter un gène codant pour une protéine ou
une enzyme souhaitée chez un autre micro-organisme. Les recombinants génétiques ainsi
obtenus peuvent donc exprimer un grand nombre de propriétés. Ils peuvent ainsi réunir les
propriétés de plusieurs micro-organismes. Actuellement on note une expansion de
l'utilisation de ces recombinants dans les bio-industries malgré l'opposition de certains
consommateurs et de certains milieux scientifiques qui estiment que le génome de ces microorganismes
n'est pas suffisamment connu et que les résultats des manipulations génétiques
comporteraient une part importante de hasard (biohasard).
Le génome des bactéries lactiques
Le terme génome est utilisé pour l'ensemble constitué par le chromosome, les
plasmides et autres structures génétiques corrune les éléments transposables et les prophages.
Le génome des bactéries lactiques est très étudié actuellement. Des travaux récents
montrent qu'il est constitué d'un chromosome de taille comprise entre 1,8 et 3,4 Mbp. En
plus de ce chromosome des plasmides sont habituellement présents chez les espèces des
genres Lactococcus, Lactobacillus et Pediococcus. Ces plasmides sont peu fréquents chez
Streptococcus thermophilus et chez les Lactobacillus intestinales. Des éléments IS ont été
,/
8

MATERIEL ET METHODES

1. ECHANTILLONS DE VIN DE PALME ET ORGANISMES DE REFERENCE
1.1 Echantillons de vin de palme
Les échantillons de vin de palme utilisés proviennent de différentes régions du Sénégal.
T a bleau
3 : O· ngme . et composltlün des ec 'hantlIlons d evm. de
pa me.
Echantillon Nature Origine
4 Sève fraîche. Niayes-Diender
5 Sève fraîche Niayes- Diender
7 Vin de palme fini (durée de la fermentation = 24 heures) Cambérène
8 Vin de palme fini (durée de la fermentation = 72 heures) Casamance
1.2 organisme de référence
1.2.1 Plasmide utilisé pour le clonage
Le plasmide pSUl est utilisé comme vecteur pour la transformation de E. coli, sa taille est
de 4,5 Kb (figure 3).
Figure 3: Schéma du Plasmide pSUl
./
10

1.2.2 Bactéries utilisées comme référence
Les souches bactériennes utilisées comme référence sont énumérées dans le tableau 4.
Tableau 4 : Souches bactériennes de référence
Souche Références
Laclobacillus ferll1enlUm
Laclobacillus planlarum
Lactobaciflus amylovorus
Lactobacillus amylophilus
LaCIObacilfus pentosus
LaCIObacillus frUClivorans
Laclobacillus brevis
Laclobacillus curvalus
Pediococcus inopinalus
Pediococcus acidilacfici
Pediococcus parvulus
Pediococcus penlosaceus
Pediococcus dextranicus
LeuconosfocfruCfosus
Leuconosloc carnOSUI17
Leuconosloc cilreum
Leuconosfoc gelideum
Leuconosfocfallax
Leuconostoc lactis
Weissella paramesenleroides
Oenococcus oenis
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
./
OSM 20052
LTH 232
LTH 503
LTH, non publiée
LTH482
OSM20203 T
OSM 22054 T
TMW 1.2
TMW2.2
LTH, non publiée
OSM 20333 T
DSM 20336
OSM 20335 T
LTH, non publiée
OSM 5576
OSM 5577
DSM 5578
OSM 20189
OSM 20202
OSM 20288
OSM 20252
JM 109
JM89
HB 101
./
11

2. MILIEUX D'ISOLEMENT ET ADDITIFS
2.1 Milieux de culture des bactéries lactiques
L'isolement des souches bactériennes a été effectué sur les milieux MRS (De Man et al.,
1960) et standard 1.
Milieu MRS:
Peptone de caséine (digestion trypsique)
Extrait de viande
Extrait de levure
D(+) Glucose
Tween 80
Acétate de sodium
Citrate d'ammonium
Phosphate bipotassique
Sulfate de magnésium
Sulfate de manganèse
Eau distillée
10 g
10 g
5 g
20 g
1 g
5 g
2 g
2 g
0,28 g
0,05 g
qsp 1 litre, pH 6,5.
Les milieux MRS-agar renferment 14 g/I d'agar-agar. Cette forte concentration en acétate
de sodium permet l'inhibition de la croissance des levures.
2.2 Milieu sélectif pour les levures
Le milieu PEG (Peptone-Extrait de levure-Glucose) contenant 100 mg/l de
chloramphénicol est utilisé comme milieu d'isolement et d'enrichissement pour les levures.
Milieu PEG:
Extrait de levure
Glucose
Peptone de farine de soja
Eau distillée
10 g
30 g
10 g
qsp 1 litre.
2.3 Milieu pour la détection de la production de bactériocine (BSM)
Milieu BSM:
Peptone de caséine (digestion trypsique)
Extrait de viande
Extrait de levure
D(+) Glucose
Tween 80
Phosphate bipotassique
Phosphate potassique
Sulfate de magnésium
Sulfate de manganèse
Agar
Catalase
Eau distillée
,/
2 g
10 g
4 g
2 g
1 g
8 g
8 g
0,28 g
0,05 g
14 g
1 mg/ml
qsp 1 litre
,/
12

2.4 Milieu pour l'étude du pouvoir fermentaire
Peptone de caséine
Extrait de viande
Extrait de levure
Tween 80
Mélange de sels*
L-Cysteine x HCI
Bromocrésol pourpre
Eau distillée
*Composition du mélange de sels:
Acétate de sodium
Citrate d'ammonium
Phosphate potassique
Phosphate dissodique
Sulfate de magnésium
Sulfate de manganèse
2.5 Milieu pour l'étude de l'activité amylolytique
Peptone de caséine
Extrait de levure
Phosphate bipotassique
Amidon
Bromocrésol pourpre
Eau distillée
2.6 Milieux utilisés pour le clonage
Milieu LB
Peptone de caséine
Extrait de levure
Chlorure de sodium
Eau distillée
Milieu TEX
Peptone de caséine
Extrait de levure
Eau distillée
Milieu SOC
Peptone de caséine
Glucose
Chlorure de magnésium
Chlorure de sodium
Chlorure de potassium
Sulfate de magnésium
Eau distillée
20 g
4 g
14 g
1 g
12,5 g
0,4 g
0,4 g
qsp 1 litre.
100 g
10 g
5 g
5 g
0,2 g
0,2 g
10 g
10 g
5 g
3 g
0,5 g
qsp 1 litre, pH 7,2 à 7,5
10 g
5 g
5 g
qsp 1 litre, pH 7,2 à 7,5
16 g
10 g
qsp 1 litre, pH 7,2 à 7,5
20 g
5 g
20 mM
10 mM
2,5 mM
5 mM
qsp 1 litre, pH 7,0
13

2.7 Additifs
2.7.1 La catalase
La catalase est une peroxydase qui décompose l'eau oxygénée en eau et en oxygène. L'eau
oxygénée est un produit de la chaîne respiratoire chez les bactéries aérobies. Elle est
toxique, son accumulation dans le milieu de culture inhibe la croissance des bactéries
dépourvues de catalase. L'addition de la catalase au milieu BSM permet la destruction de
l'eau oxygénée susceptible d'interférer sur les résultats.
La catalase est mise en solution dans de l'eau distillée. Cette solution est stérilisée par
filtration et ajoutée au milieu de culture après autoclavage et refroidissement à SO°e.
L'addition de catalase et la faible concentration en glucose dans ce milieu permettent
d'éviter respectivement une éventuelle intluence de l'eau oxygénée, ou d'acides issus du
métabolisme, sur la croissance de la souche test.
2.7.2 Les antibiotiques
Les solutions d'antibiotiques sont stérilisées par filtration et conservées à -20°e. Elles ne
seront décongelées et additionnées aux milieux de culture qu'après autoclavage et
refroidissement à SO°e.
l'actidione (cycloheximide)
l'actidione bloque la réaction de translocation au niveau des ribosomes des cellules
eucaryotes; dans les milieux de culture elle inhibe la croissance d'un grand nombre de
champignons non pathogènes qui sont souvent isolés à partir de produits alimentaires. Son
addition dans le milieu MRS permet un meilleur isolement des souches bactériennes.
Le chloramphenicol
Le chloramphenicol est un antibiotique relativement thermostable, à large spectre
antibactérien. Il bloque la réaction de la peptidyltransférase ribosomale chez les
procaryotes. Il est utilisé pour faciliter l'isolement des levures et autres champignons.
L'ampicilline
L'ampicilline est utilisée dans le milieu LB pour empêcher la croissance des souches E.coli
n'ayant pas reçu le vecteur pSU!.
2.7.3 Les indicateurs colorés
Les indicateurs colorés sont stérilisés avec les milieux de culture.
Le rouge de phénol
Le rouge de phénol est un indicateur de pH très sensible utilisés pour la fermentation des
hydrates de carbone. Le changement de coloration, virage du jaune au rouge indique une
variation du pH de 8,4 à 6,8.
/'
14
/'

Le pourpre de bromocrésol
Le pourpre de bromocrésol est utilisé pour la détection de l'activité amylolytique.
L'acidification se traduit par un virage du milieu du bleu au jaune, (variation de pH de 6,8
à 5,2).
15

3. ISOLEMENT DE LA MICROFLORE (figure 4)
3.1 Dénombrement et isolement des colonies
A partir de chaque échantillon de vin de palme on réalise des dilutions successives de 10-1
à 10- 7 . La solution de dilution est constituée de 1% peptone et de 0,85% NaCl. Pour
chaque dilution on étale un volume de 100 J..lI sur milieux solides (MRS-agar, NBB-agar et
standard I-agar pour le comptage des colonies bactériennes et PEG-agar pour les levures).
Le dénombrement se fera après 72 heures de croissance à 37°C sous une atmosphère
constitué de 90% d'azote et 10% de gaz carbonique. Le résultat est exprimé en unité
formant une colonie par millilitre d'échantillon examiné. Les colonies dont le nombre est
supérieur à 1.10+ 5 UFC/ml d'échantillons feront l'objet de plusieurs ensemencements sur
lvfRS-agar pour l'obtention de cultures pures.
3.2 Les critères de sélection de micro-organismes du vin de palme
Toutes les colonies à gram positif et catalase négatif seront sélectionnées. Tandis que les
colonies ne remplissant pas ces conditions ne le seront que si elles sont productrices au
moins d'amylase et / ou de bactériocine ou si elles sont présentes en grand nombre (de
l'ordre de 10+ 6 UFC/ml d'échantillon étudié ).
3.3 Réalisation d'une collection de micro-organismes du vin de palme
Pour chaque souche sélectionnée, on fera une culture de longue durée qui entrera dans la
collection de micro-organismes du vin de palme.
Pour la réalisation de cultures de longue durée, on centrifuge 10 ml d'une culture jeune
(culture d'environ 12 heures) à 5000 g pendant 10 minutes. Le sédiment ainsi obtenu sera
resuspendu, s'il s'agit de bactéries, dans un bouillon MRS frais contenant 50% de
glycérine. Chez les levures le culot sera resuspendu dans du bouillon PEG contenant 10%
de glycérine. La suspension est transférée ensuite dans un cryotube de 1,2 ml et conservée
à -80°e.
/
/
16

4. ETUDE MORPHOLOGIQUE DE LA MICROFLORE
4.1 Etude des souches bactériennes
La description de l'aspect, de la couleur, de la taille et de la forme de chaque type de
colonie se fait par observation macroscopique à l'œil nu et à l'aide d'une loupe. L'étude
des formes cellulaires est faite par observation à l'immersion à l'aide d'un microscope
optique. On déterminera aussi la mobilité et la présence de spores.
4.2 Etude morrhologique des levures
La taille et la forme des cellules, le type de reproduction bourgeonnement, scissiparité
seront étudiés après 24 à 48 heures d'incubation sur PEG-agar. L'aptitude à former des
filaments mycéliens et la structure de ces mycéliums sont étudlées après 7 à 14 jours
d'incubation sur milieu acétate-agar. Chez les levures présentant une phase de reproduction
sexuée, on peut noter la présence de spores à tout moment de la croissance et dans tous les
milieux de culture utilisés dans cette étude. Sur des prélèvements régulièrement effectués
on procédera à un examen direct et à un examen après coloration pour détecter la présence
de spore et le type de spore.
18

5. ETUDE DES CARACTERES BIOCHIMIQUES
5.1 Caractères biochimiques des bactéries
5.1.1 Coloration de Gram et lyse par le KOn
-Coloration de Gram
La Coloration de Gram est basée sur la résistance des parois bactériennes, ce qui se
traduit chez les souches colorées au violet cristal à résister diffèrentiellement à la
décoloration par l'alcool. Elle se fait sur des cultures de 12 à 24 heures.
Solutions colorantes utilisées
-Solution de violet cristal:
Solution A (Violet cristal 2 g +Ethanol 96%) +Solution B (Oxalate d'ammonium O,Sg +
eau distillée 80 ml).
-Solution de safranine : (Safranine 0,25 g +Ethanol 10 ml +Eau distillée 90 ml)
-Solution iodo-iodurée : (Lugo!)
Technique
Faire sécher une mince préparation sur une lame. Fixer rapidement à la flamme. Recouvrir
de violet cristal, laisser agir 15 secondes. Rincer deux fois pendant 15 secondes avec le
lugol. Décolorer aussitôt à l'éthanol jusqu'à ce que l'éthanol n'entraîne plus de colorant.
Laver rapidement à l'eau courante. Recolorer avec la safranine diluée pendant 15 secondes.
Rincer abondamment, sécher et observer à l'immersion.
-Lyse par le KOlI
Ce test est basé sur la résistance de la paroi. Les souches gram négatif montrent une lyse
rapide en présence de KOH. ri est pratiqué sur des cultures en phase exponentielle sur
MRS-agar. Sur une lame porte-objet on mélange une colonie avec une goutte de solution
3% KOH. Au bout de 5 à 1°secondes, il se produit une lyse chez les souches Gram
négatives, ce qui se traduit par J'apparition sur la lame de matériels intracellulaires gluants.
Ce test n'est pratiqué que pour confirmer un résultat de la coloration de Gram.
5.1.2 Test de la catalase
Ce test permet la mise en évidence de la catalase. Cette enzyme est généralement absente
chez les bactéries anaérobies strictes.
Technique:
On effectue directement une émulsion à l'aide d'une pipette pasteur de culture bactérienne
jeune dans 3 gouttes d'une solution 3 % d'eau oxygénée, la présence de catalase se traduit
par l'apparition de bulles de gaz. S'il n'y a pas de dégagement gazeux au bout de 15
secondes la réaction est négative.
,/
19

5.1.3 Production de gaz
La production de gaz est étudiée sur MRS-bouillon sans extrait de viande et avec 2,5 % de
maltose. Un tube à essai contenant une cloche de Durham renversée et la ml de milieu de
culture est ensemencé avec la souche à étudier. La présence de bulles dans le tube
renversé, après incubation indique une production de gaz (Gaz +).
5.1.4 Fermentation des hydrates de carbone
Le pouvoir fermentaÎre sera étudié sur les hydrates de carbone suivants: L(+)arabinose,
gl uconate de sodi um, D(-)fructose, D(+)gl ucose, D(-)mannose, lactose, mélibiose,
maltose, saccharose, tréhalose, mélézitose, raffinose, esculine, D-salicine, p-arbutine,
D(+)galactose, D(-)Mannitol, sorbitol, D(-)ribose, D(+)xylose, N-acétyl-D-glucosamine,
amygdaline et celJobiose. Pour chaque sucre, on réalise une solution 2%. Toutes ces
solutions seront filtrées exceptée la solution d'esculine qui sera autoclavée à 121°C
pendant 10 mn. Les tests se feront sur plaques pour microtitration (cupule en U), Chaque
cupule recevra 100 III de solution d'hydrate de carbone, 40 III de paraffine stérile et 40 III
d'urle suspension de la souche à étudier dans le milieu de culture prévu pour ce test (voir
composition du milieu pour étude du pouvoir fermentaire). Les plaques ainsi remplies sont
incubées à 30°C, la lecture se fait jusqu'au sixième jour incubation.
5.1.5 Activité amylolytique
La fermentation de l'amidon est étudiée sur un milieu solide en boîte de petri contenant 3 g
d'amidon soluble. Après 48 heures d'incubation, on recouvre la surface de la culture par
une solution de lugol. Une réaction positive (amylase +) se traduit par une zone claire
autour des colonies, le reste de la boite étant violet. Pour la détection des recombinants
E.coli (amy+), vu le nombre impol1ant de souches à tester, on fait la culture dans le même
milieu mais en présence de bromocrésoJ pourpre, ce qui permet de déceler, par le virage
du bleu au jaune, les recombinants amylase positif.
5.1.6 Production de bactériocine
Ensemencer le milieu BSM-agar en déposant en surface 1111 d'une culture de 16 heures de
la souche à étudier. Après séchage, on incube la culture à 25°C pendant 24 heures dans des
conditions de microaérophilie, puis on recouvre la surface de la boîte de petri avec 140 ml
de culture de la souche test. On incube encore pendant 16 à 20 heures dans les mêmes
conditions. S'il y a production de bactériocine active sur la souche indicatrice, il se fonne
une zone d'inhibition autour de la zone de croissance de la souche productrice.
5.2 Caractères biochimiques des levures
5.2.1 Hydrolyse de l'urée
Un bouillon contenant de l'urée (2%) est ensemencé avec une préculture de la souche à
tester et incubé à 37°C. Ce bouillon est mauve à l'état frais, l'hydrolyse de l'urée se traduit
par une a1calinisation du milieu qui prend une teinte rosée puis rouge dans une durée qui
ne dépasse pas 4 heures.
./
20

5.2.2 Auxanogramme
L'utilisation de certaines substances comme unique source de carbone ou d'azote sera
étudiée sur milieux solides. Ces milieux sont inoculés avec 100 III d'une suspension
obtenue à partir d'une culture de 24 heures (2 anses de culture dans 1 ml d'eau distillée
stérile). La suspension est étalée à l'aide d'une pipette coudée stérile. Puis on dépose en
cercle à la surface de la gélose les disques. II s'agit de disques de 0,6 cm de diamètre,
imprégnés de 2 gouttes d'une solution à 20 % de la substance à étudier. L'incubation est
faite à 30°C, en aérobiose. La lecture est effectuée 24 à 48 heures après l'ensemencement.
La présence d'une zone de croissance autour du disque est considérée comme un résultat
positif
Sources de carbone
Pour les sources de carbone les quinze substances suivantes sont testées : maltose,
raffinose, galactose, cellobiose, tréhalose, D-mannitol, érythritol, inositol, mélibiose, Dxylose,
L-arabinitol, 2-céto-D-gluconate, DL-lactate, D-glucuronate et citrate. On dispose
donc 5 substances par boîte de petri. Le milieu de base est le milieu azote base-agar
(Difco) qui renferme 5 g/l de sulfate d'ammonium comme source d'azote, les vitamines, les
acides aminés, et les sels minéraux nécessaires.
Sources d'azote
Pour les sources d'azote on s'intéressera au nitrate et à la cadavérine. Le milieu de base est
le milieu carbone base-agar (Difco) contenant vitamines, acides aminés, sels minéraux
nécessaires et 20 gli de glucose.
5.2.3 Fermentation du glucose
Le pouvoir fermentaire est mis en évidence par la production de gaz dans un tube à essai
contenant une cloche Durham renversée dans un bouillon composé d'une solution de
glucose 2% et d'une solution à 1% d'extrait de levure. Le bouillon est inoculé avec une
culture âgée de 24 heures maximum incubé à 28°C. La lecture est effectuée 1 jour à 3
semaines après l'ensemencement. La fermentation du glucose se traduit par une production
de gaz qui s'accumule dans la cloche renversée.
5.2.4 Résistance à la cycloheximide
La résistance à la cycloheximide est testée sur bouillon carbone base contenant seulement
0,5% de glucose. On testera la croissance avec 0,01% et 1% de cycloheximide. Le résultat
ne sera considéré comme négatif que s'il n y a pas de croissance au bout de 7 jours
d'incubation à 30°C.
5.2.5 Résistance à l'acide acétique
La résistance à l'acide acétique est testée sur milieu PEG-agar contenant 1% d'acide
acétique. La lecture du résultat se fera après 6 jours d'incubation à 30°C.
21

5.2.6 Croissance sur PEG à 60% glucose
Cette expérience se fait sur gélose PEG en pente. La gélose est incubée avec une culture
de 24 heures et incubée à 28°C. L'absence de croissance au bout de deux semaines traduit
un résultat négatif.
5.2.7 Confection d'arbres phylogénétiques à partir de l'analyse FTIR
Le spectrophotomètre utilisé est lié à un système d'analyse de données basé sur l'analyse
statistique multivariable. Il permet de dresser des arbres phylogénétiques pour les levures
en se basant, surtout, sur la zone d'absorption des acides gras qui composent les lipides
membranaires.
Technique
Les différentes souches de levure sont cultivées sur milieu PEG-agar à 30°C jusqu'à la
phase exponentielle de croissance. Les cellules sont récoltées par centrifugation, lavées et
séchées sous vide avant d'être mise dans une solution de KEr pour l'analyse.
L'appareil utilisé est un FTIR-spectrophotomètre IFS 66.
./
22

6. EXTRACTION ET PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES
6.1 Extraction d'acides nucléiques chez les bactéries
6.1.1 Extraction et purification d'ADN chromosomique (Lev.;ington el al. ,1987)
Les réactifs:
Solution de tampon trls-EDTA
Solution de lysozyme:
Solution de mutanolysine :
Solution SOS:
Solution de chlorure de sodium:
Chisome:
SOmM Tris!HCl +SOmM NaCI +10mM EDTA, pH 8,0
10 mg/ml lysozyme dans SO mM de tris!HCI
SOOO unités / ml mutanolysine dans 0,1 M de solution
phosphate de sodium, pH 6,2.
2S % SOS dans l'eau distillée
S MNaCl
Solution acétate de sodium-EDTA: 3 M Acétate de sodium
0,01 M EDTA, pH 7,0
Solution de Ribonucléase A :
Solution de Protéinase K :
Solution TE
Ethanol absolu:
70 % Ethanol:
Mode opératoire:
Chlorofonne / Alcool isoamyl igue (24/1) (v/v)
O,S mg/ml RNase dans 2 x SSC , pH, 7,S ; faire chauffer
à iOO°C pendant 10 mn pour activer les DNase.
JO mg/ml Protéinase K (Boeringer-Mannheim)
Tris 10 mM + EDTA 1 mM, pH 8,0
Prélever 1ml d'une culture de 12 à 18 heures. Centrifuger à 12000 g pendant S mn à
température ambiante. Laver les résidus avec 1 ml de solution TTE puis resuspendre dans
100 ml de TTE.
-Lyse des cellules:
Ajouter lS ml de solution de lysozyme et 1 ml de mutanolysine et incuber à 37°C pendant
lS à 30 mn (environ lS mn pour E. coli et 30 mn pour certaines bactéries gram positif).
Ajouter 40 ml de solution SDS pour optimiser la lyse. Incuber à -6SoC (inactivation des
DNase). Agiter au vortex pendant S mn pour séparer l'ADN des autres constituants
cellulaires.
/
23

-Séparation de l'ADN des autres constituants cellulaires:
Additionner 33 ml de solution de cWorure de sodium, puis incuber 1 heure au minimum
dans de la glace, centrifuger à 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis récupérer la phase
supérieure dans un nouveau tube Eppendorf Ajouter 1 volume de chisome, homogénéiser,
centnfuger à 12000 g pendant 5 mn à 4°C puis récupérer la phase liquide dans un nouveau
Eppendorf
-Précipitation par l'éthanol:
Ajouter 1/9 volume d'acétate de sodium et 2,5 volumes d'éthanol absolu. Incuber ensuite à
-20°C pendant 30 mn puis centrifuger à 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis éliminer la
phase liquide et faire sédimenter les résidus contenant les acides nucléiques avec 1 ml
d'une solution de 70% d'éthanol préalablement refroidie. Laver le culot avec de l'éthanol et
sécher sous vide.
-Purification enzymatique:
Au culot séché et Javé, ajouter 100 ml d'une solution T.E. contenant 10 mg/ml de RNase et
incuber 30 mn à 37° Ajouter 1 ml de la solution de protéinase K et incuber pendant 1
heure à 37°C. Extraire J'ADN avec 1 volume de chisome. Précipiter avec l'éthanol comme
précédemment. Suspendre le culot obtenu dans de la solution T.E. ou de l'eau bidistillée
stérile.
6.1.2 Extraction rapide d'ADN /ARN (Stahl el al. , 1987, modifié)
Les réactifs:
Solution TE: (voir 6.1.1)
Solution SDS : (voir 6.1.1)
Chisome: (voir 6.1.1)
Phénol / Chisome :
Solution d'acétate de sodium:
Mode opératoire:
(1/1) (VN)
3 M, pH 7,0
A partir d'une culture jeune de 12 à 18 heures. Centrifuger 10 ml de culture 5000 trs/mn,
4°C, pendant 15 mn. Laver les sédiments avec 1 ml de solution T.E. Suspendre les
sédiments dans 400 III de solution TE dans un microtube (Sarstedt, Rommelsdorf. Ajouter:
50 III SDS + 400 III de billes de verre stériles (0,17- 0,18 mm ; Braun, Melsungen) + 400
III de phénoUChisome. Bien mélanger puis casser les cellules à l'aide d'un bain à ultrason
(Banelin Sonorex TK 52 Transistor, Bachhofer, Reutligen) ; la durée de cette opération ne
doit pas excéder 2 mn. Incuber le mélange à 65°C pendant 10 mn puis centrifuger 12000 g
pendant 15 mIl à température ambiante. Prélever à l'aide d'une pipette le surnageant
contenant les acides nucléiques dans un tube Eppendorf stérile. Addition d'un volume de
chisome. Agiter pendant 5 mn pour mélanger les deux phases. Centrifuger à 12000 g
/"
24

pendant 5 mn à température ambiante et récupérer la phase liquide. Additionner à la phase
liquide récupérée 1/9 volume d'acétate de sodium et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à _
20°C, mélanger doucement et brièvement et laisser précipiter pendant une heure au
minimum à -20°C. Centrifuger 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis éliminer la phase
liquide. Décanter le résidu avec 1 ml d'éthanol 70%. Centrifuger à 12000 g pendant 5 mn
à 4°C puis éliminer la phase liquide. Suspendre dans 100 ml d'eau bidistillée stérile ou de
solution T.E..
6.1.3 Extraction et purification d'ADN (Marmur et al. ,1961, modifié)
Les réactifs:
Chloroforme:
Solution de citrate trisodique 20 X SSC :
Sol ution de tampon tris-EDTA : (voir 6.1.1)
Solution de lysozyme: (voir 6.1.1)
Solution de mutanolysine : (voir 6.1.1)
Solution SDS : (voir 6.1.1)
Solution de chlorure de sodium: (voir 6.1.1)
Chisome: (voir 6.1.])
Solution d'acétate de sodium-EDTA :
Solution de Ribonucléase A :
Solution de Protéinase K :
Solution TE: (voir 6.1.1)
Isopropanol:
70 % Isopropanol :
Mode opératoire:
-Lyse et séparation des constituants cellulaires.
3 M Nacl +0,3 M citrate de sodium, pH 7,0
3 M Acétate de sodium 0,01 M EDTA, pH 7,0
0,5 mg/ml RNase dans 2 x SSC, pH, 7,5 ; faire
chauffer à lOO°C pendant 10 mn inactiver les
DNase.
1°mg/ml Protéinase K
Centrifuger 1 litre de culture à 5000 g pendant 30 mn et à température ambiante.
Suspendre les sédiments dans une solution de tampon EDTA (10 ml /g de sédiment) et
laisser refroidir à -20°C pendant 1 heure minimum. Ajouter la solution de lysozyme (10
Ill/ml de suspension cellulaire). Ajouter la solution de mutanolysine (lill/ml de suspension
cellulaire). Incuber pendant 10 à 60 mn à 37°C, sous agitation. La lyse des cellules se
./
./
25

traduit ici par l'apparition de viscosité dans le tube. Ajouter une solution 25 %SDS jusqu'à
une concentration finale de 2% SDS. Incuber à 60°C pendant 10 mn pour inactiver les
DNases. Additionner le chlorure de sodium jusqu'à une concentration finale égale à lM.
-Extraction au chloroforme
Additionner un volume de chloroforme, agiter doucement pendant 10 à 15 mn et
centrifuger à 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis récupérer la phase liquide. Répéter
l'extraction au chloroforme tant qu'il y a une interface visible entre les deux phases après
cent ri fugation.
-Précipitation à l'isopropanol
Ajouter 119 volume de la solution d'acétate de sodium-EDTA et 2,5 volumes
d'isopropanol. Agiter lentement jusqu'à apparition dans la solution d'un culot visqueux; ce
culot est fonné d'acides nucléiques, de protéines et de sels. Faire adhérer par simple
rotation ce culot au bout effilé d'une pipette stérile. Dissoudre à nouveau le culot dans
une solution O,IM de citrate trisodique Additionner une solution de citrate trisodique 20
fois concentrée jusqu'à obtention d'une concentration finale égale à une fois citrate
trisodique. Additionner du NaCl jusqu'à une concentration finale en NaCI égale à lM.
-Purification enzymatique
Ajouter une sol ution de RNase jusqu'à une concentration égale à 10 mg/ml de RNase et
incuber 30 mn à 37°. Ajouter la solution de protéinase K jusqu'à une concentration égale à
50 mg/ml et la solution de SDS jusqu'à une concentration égale à 1% et incuber pendant 1
heure à 37°C. Extraire J'ADN avec 1 volume de chloroforme et précipiter la phase
supérieure avec de ]'isopropanol comme précédemment. Récupérer l'ADN comme
précédemment et Suspendre le culot obtenu dans de la solution T.E. ou dans de l'eau
bidistillée stérile.
6.1.4 Extraction d'ADN plasmidique
6.1.4.1 Extraction ra pide (l Frère, 1991 )
Les réactifs:
Solution I :
Solution II :
Solution III :
Phénol 1chloroforme 1Alcool isoamylique (voir 6.1.1)
Solution TE :
Mode opératoire:
10mM EDTA+50mM Tris, pH7,5+100flg/l RNase A
0,2 M NaOH +1 % SDS
2,55 M Acétate de potassium, pH 4,8.
(voir 6.1.1)
Centrifuger 10 ml de culture et récupérer le culot dans 300 III de solution l refroidie.
/'
26

Additionner 300 mg de bille de verre et broyer au vortex pendant 30 secondes à la vitesse
maximale. Additionner de 300 III de solution II, homogénéiser en agitant doucement et
laisser 5 minutes à température ambiante. Ajouter ensuite 300 III de solution III.
Centrifuger à 10000 g pendant 5 minutes et récupérer la phase supérieure dans un nouveau
tube. Extraire les protéines avec 600 III de phénol/chisome, homogénéiser doucement puis
centrifuger à 10000 g à température ambiante pendant 5 minutes, puis récupérer la phase
supérieure contenant l'ADN plasmidique dans un nouveau tube et précipiter avec 1 volume
d'isopropanol centrifuger à 15000 g à 4oC pendant 10 minutes et récupérer le culot. Après
séchage l'ADN plasmidique est dissout dans 20 III de solution TE.
6.1.4.2 Extraction d'ADN plasmidiquc (Anderson et McCay, 1983)
Les réactifs:
Solution STE: 6,7% Saccharose
50mM Tris (HCI)
1mMEDTA
(Pour les autres réactifs voir 6.1.1 et 6.1.2)
Mode opératoire:
Prélever 10 ml d'une culture de 12 à 18 heures, centrifuger 12000 g pendant 10 mn à 4°C.
Laver les résidus avec 1ml de solution STE puis resuspendre dans 380 ml de STE.
-Lyse des cellules
Ajouter 96 III de la solution de lysozyme et incuber à 37°C pendant une heure avant
d'ajoutant 48 III de solution de SDS pour optimiser la lyse. Incuber à -65°C jusqu'à ce que
la suspension devienne claire. Ajouter 28 pl de la solution de soude et agiter pendant 10
minutes à température ambiante. Ajouter 50 III de la solution de Tris et agiter pendant 3
minutes à température ambiante. Additionner 72 III de solution de chlorure de sodium et
bien agiter pour homogénéiser le mélange.
-Séparation de l'ADN des autres constituants cellulaires (e>..1raction au phénol)
Additionner de 80 III de phénol, centrifuger à 5000 g pendant 10 mn à 4°C puis récupérer
la phase supérieure dans un nouveau Eppendorf. Extraire avec 400 III de Phénol/Chisome,
puis avec 400 III de Chisome.
-Précipitation par l'éthanol
Ajouter 1/9 volume d'acétate de sodiumlEDTA et 2,5 volumes d'éthanol. Incuber ensuite à
-20°C pendant 30 mn. Centrifuger à 12000 g pendant 20 mn à 4°C puis éliminer la phase
liquide. Sédimenter les résidus contenant les acides nucléiques avec 1 ml d'une solution de
70% d'éthanol préalablement refroidie. Laver le culot avec de l'éthanol et sécher à l'aide
d'une pompe à vide ou à l'air libre.
./ /"
27

7. CONCENTRATION DES ACIDES NUCLEIQUES
7.1 Electrophorése sur gel d'agarose
A l'aide d'un gel d'agarose il est possible de séparer différents fragments d'acides
nucléiques suivant leur taille, de purifier, d'isoler et d'identifier ces fragments.
Les réactifs
-Solution TAE 50 x concentrée :(EDTA 0,1 M+Acide acétique 1 M+Tris 2M, pH 8,2).
-Solution de migration :(Saccharose 40% (plv ) dans de l'eau+EDTA 50mM+Bleu de
bromophénol 0,25%+Xylénecyanol 0,25%).
-Bromure d'ethidium : Imglml dans de l'eau distillée. Le bromure d'ethidium permet de
colorer le gel. L'intensité des bandes d'acides nucléiques après coloration est
proportionnelle à la concentration.
Les marqueurs
Des marqueurs standards sont utilisés pour mesurer la taille des acides nucléiques. La
taille des fragments des marqueurs de gel est donnée en bases paires. Les marqueurs
utilisés dans cette étude sont:
-Standard 111 (Boehringer, Mannheim)
-Standard III marqué au dioxigénine (Boehringer, Mannheim)
-Standard VIlI (Boehringer, Mannheim)
Gel d'agarose
On utilisera des gels de 0,8 à 1,2% d'agarose (Boehringer, Mannheim ). Le volume total du
gel est de 80 ml pour une petite électrophorése et de 200 ml pour une grande
électrophorése.
Appareillage
Un appareil MWG-Biotech, 12x14 cm permet de fournir un courant continu de 100 mA et
80V. Un appareil Herolab E.A.S.Y. Store (Gel Documentation Système) muni d'une
caméra 429K à lumière U. V. permet de photographier le gel. La durée de l'électrophorése
est de 45 mn à 1h pour un screening simple et 3h pour un gel de PCR avec l'amorce
arbitraire M13. Le temps de coloration au bromure d'éthidium est de 20 mn.
7.2 Spectrophotométrie
Le principe de cette spectrophotométrie repose sur le fait que les acides nucléiques
présentent un maximum d'absorption dans l'U.V. On peut ainsi déterminer la
concentration et la pureté d'un échantillon:
-1,0 unité à 260 nm correspond à une concentration de 50 Jlglml d'ADN bicaténaire ou de
40Jlglml pour une ADN monocaténaire (Maniatis et al., 1982).
-L'ADN donne un pic d'absorption spécifique à 280 nm. La présence de tout autre pic
témoigne de l'existence d'impuretés.
/
29

.
Ta hleau
9 . Programme
pour l'ampli
IIiIcatlon
avec 'amorce arbitraire M 13
Nombre
Réaction Température/Durée de
cycles
94°C /3mn
Amplification initiale: 40°C / Smn 3
72°C / Smn
Dénaturation: 94°C / lmn
Hybridation: 60°C /2mn 32
Extension: 72°C / 3mn
8.5 Purification des produits de PCR
Après les réactions de PCR une purification du produit final est souvent nécessaire surtout
si le produit doit être utilisé par la suite pour un séquençage. Cette purification permet de
séparer le matériel nucléique amplifié du reste de réactifs utilisés. La méthode de
purification utilisée est celle de la précipitation par une solution d'acétate d'ammonium.
Technique
Mélanger le produit de PCR avec un volume de solution d'acétate d'ammonium 4M et 2
volumes d'isopropanol absolu. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 mn.
Centrifuger pendant 15 mn à 12000 g. Laver les sédiments avec une solution de 70%
d'éthanol. Sécher à température ambiante. Puis resuspendre le produit dans une solution
TE.
/'
34

./
9. HYBRIDATION AVEC SONDES GENETIQUES
L'hybridation des acides nucléiques est la formation d'une molécule duplex à partir de
deux chaînes d'acides nucléiques complémentaires. Il existe différentes techniques
d'hybridation. Dans cette étude nous avons utilisé la technique dite Dot Blot. Cette
technique permet de tester, pour une sonde donnée et sur une même membrane, un grand
nombre d'acides nucléiques. Un appareil MinifoldR-Apparatur (Schleicher et Schüll,
Dassel) permet de déposer séparément des quantités convenables de chaque solution
d'acide nucléique à tester sur la membrane. Pour chaque membrane on testera une ADN
donnant une réaction positive à la sonde.
9.1 Les sondes et le ma rquage
Les sondes d'acides nucléiques sont donc des fragments monocaténaires d'ADN qui sont
capables de reconnaître des fragments complémentaires et de s'hybrider à eux de manière
spécifique. Une sonde génétique doit être hautement spécifique. La longueur des sondes
est soit de 15 à 50 bases (oligonucléotides) de 50 à environ 1000 bases (polynucléotides ).
Ces sondes sont soit isolées d'organismes connus, soit synthétisées au laboratoire
(Schleifer et al., 1992; Schleifer et al., 1992). Un test avec sonde génétique comprend six
étapes qui sont: l'isolement du matériel nucléique à tester, la fabrication et le marquage
des sondes, le transfert et la fixation des acides nucléiques sur membrane, la
préhybridation, l'hybridation proprement dite et la détection des hybrides.
Tableau 10: Les sondes génétiques utilisées
Sonde S'-Séquence-3' Spécificité Référence
Lba GTAAATCTGTTGGTTCCGC Lb. acidophilus Hertel et al. (1993)
Lbb TGTTGAAATCAAGTGCAAG Lb. brevis Vogel et al. (1994)
Lbfe GCGACCAAAATCAATCAGG Lb. fermentum Vogel et al. (1994)
Lbfr CTCGCTGCTAACTTAAGTC Lb. fructivorans Vogel et al. (1994)
Lbl TCGGTCAGATCTATCGTC Lb.lindneri Ehrmann (1994)
Lbpe TCAAATGTAAATCATGATG Lb. pentosus/plantarum Ehnnann (1994)
Lbpo GGTAATCCATCGTCAAATC Lb. pontis Vogel et al. (1994)
Lbs TTAATGATAATACTCGATT Lb. sake Hertel et al. (1991)
Toutes ces sondes sont déduites de la séquence de nucléotides du gène 16S
Le marquage des sondes permet lors de la détection de rendre visible le complexe formé.
Les marquages les plus couramment utilisés sont ceux faits avec des isotopes radioactifs
surtout le 32p (phosphore-32). Ce marquage se fait sur la terminaison 5' des sondes. Ainsi
les signaux positifs sont facilement détectés lorsqu'on radiographie la membrane.
L'intensité de la bande radioactive correspondante sur l'autoradiogramme sera directement
proportionnelle à la quantité d'acide nucléique spécifique présente. Cette méthode n'est
pas, cependant, très commode du fait du temps de demi-vie du phosphore-32 qui est très
court et aussi du danger potentiel que représente l'utilisation de produits radioactifs.
9.1.1 Marquage des sondes à la digoxigenine (Amersham hybond broschure., 1987)
Les sondes d'oligonucléotide sont marquées grâce au DIG Oligonucléotide 3'-Tenninal
Kit (Boehringer, Mannheim) avec digoxigenine-ddUTP (Schmitz et al., 1991). Le
marquage consiste à la fixation d'une desoxynucléotide ou d'une didesoxynucléotide à la
position terminale 3'-OH de la sonde d'ADN.
./
35

Un desoxynucléotide ou un didesoxynucléotide est fixé sur la sonde à l'aide de tenninale
transférase.
Réactifs pour le marquage des sondes
Solution de réaction (5 x concentrée): lM Potassium
0, 125M Tris-HC1
1,25mg/ml Sérum albumine bovine, pH 6,6 (25°C)
Solution de CoCh : 25 mM
Solution DIG-ddUTP : 10 mM DIG-ddUTP dans de l'eau bidistillée stérile
Solution de terminale transférase: 50U/,..d dans 0,2M Potassium cacodylate lM EDTA,
200 mM KCI, 0, 2mg/ml Sérum albumine bovine,
pH 6,5 (25°C) ; Glycérine 50 % (v/v)
Solution de glycogène: 20 mg/ml
Solution de chlorure de lithium: 4M
Solution de EDTA : O,2M
Solution de Tris: 10 mM
Ethanol absolu
Ethanol 70 %
Eau bidistillée stérile
Mode opératoire du marquage:
Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, placé dans de la glace, mélanger les réactifs suivants:
-4 ,..lI de solution de réaction
-4 III de solution CoCh
-100 pmoi de solution d'oligonucléotide à marquer
-1 III Solution DIG-ddUTP
-1 III de solution terminale transférase (correspondant à environ 50 U termjnale transférase)
- 9 III d'eau bidistillée
Incuber le mélange à 37°C pendant 15 mn puis replacer le tube dans la glace.
Mélanger 1 III de la solution de glycogène et 200 III de la solution EDTA et ajouter 2 III de
ce mélange à la solution de départ pour stopper la réaction. Précipiter la solution avec 2,5
III de solution de chlorure de lithium et 75 III d'éthanol absolu préalablement refroidi à
20°C. Bien mélanger. Laisser précipiter le mélange pendant 30 mn à -70°C. Centrifuger à
12000 g pendant 20 mn à 4°C puis éliminer la phase liquide.
Précipiter les résidus avec 1 ml d'une solution 70% d'éthanol préalablement refroidie
Laver le culot avec de l'éthanol et sécher à l'aide d'une pompe à vide et dissoudre dans de
l'eau distillée et conserver la solution à -20°C.
./ ./
36

avoir un résultat optimal. Aussi est-il souvent nécessaire de recourir à une amplification du
gène à tester par PCR après l'extraction.
Dénaturation des acides nucléiques
Dénaturation de l'ARN
Mélanger lllg d'ARN avec 3 volumes de solution dénaturante (Fonnamide 72%,
Fonnaldehyde 28%) incuber le mélange à 65°C pendant 10 mn.
Dénaturation de l'ADN
Mélanger lllg à 2 Ilg d'ADN avec 1 volume de solution dénaturante (Solution de soude 0,4
M), incuber le mélange pendant 10 mn à la température ambiante.
9.3 Transfert et fixation des acides nucléiques sur membrane
Les membranes utilisées sont: Porablot NY, (Machery-Nagel, Düren), Biodyne A PALL,
(Dreieich) et Membrane à charge positive, (Boehringer, Mannheim).
Il s'agit dans les trois cas de membranes de nylon hydrophiles avec des pores de
différents diamètres. Le séchage de ces membranes se fait à l'air libre, il est suivi de la
fixation des acides nucléiques. Cette fixation se tàit soit à l'étuve réglée à 80°C pendant 15
mn soit sous une lampe à lumière ultraviolette pendant 2 mn.
9.4 Préhybridation et hybridation
Chaque membrane séchée et fixée est placée dans une étuve d'hybridation. Pour chaque
tube on testera une seule sonde. Ces tubes sont ensuite placés dans une étuve où se font la
préhybridation et l'hybridation. L'étuve pour hybridation permet de soumettre les tubes
d'hybridation à la température convenable et à une rotation dont la vitesse est réglable. La
température d'hybridation est fixée à 42°C. Et la vitesse de rotation est réglée environ à 5
tours par minute.
Solutions de préhybridation et d'hybridation
Solution SSC (20 x concentrée): 3 M NaCI
0,3 M Citrate de sodium; pH 7,0
Solution d'acide maléique:
Solution de blocage:
Solution d'hybridation:
Solution de lavage:
0,1 M Acide maléique
0,15 M NaCI ; régler le pH à 7,5 avec de la soude
10 % (plv) de poudre (Boehringer-Mannheim) dans
une solution d'acide maléique. Autoclaver et conserver à 4°C.
5 x SSC
1 % (plv) Solution de blocage
0,02 % (plv) SDS
0,1 % (plv) N-Laurylsarcosinate
2 xSDS
0,02 % (plv) SDS
./
./
38

Mode opératoire
Mouiller la membrane avec la solution 2 x SSc. Préhybrider avec 20 ml de solution
d'hybridation pendant une heure. Hybrider pendant 3 heures au minimum avec 2 ml de
Solution d'hybridation et 20 ml de solution d'oligonucléotide marquée (sonde). Laver avec
10 ml de solution de lavage pendant 10 mn à 142°C, puis avec 150 ml de solution de
lavage pendant 10 mn à 45°C afin d'éliminer les hybridations non spécifiques. La
membrane peut être alors séchée ou directement soumise à la détection.
9.5 Détection des hybrides
Nous avons donc utilisé la possibilité qu'offre les conjugats enzymatiques (Complexes
enzymatiques spécifiques) pour détecter les réactions positives. Deux complexes sont
utilisés:
-Biotine- Phosphatase alcaline /Streptavidine-Phosphatase alcaline
-Digoxigenine-Phosphatase alcaline/Anti-Digoxigenine-Phosphatase alcaline
La détection se fera dans un tambour en Plexiglas. On peut détecter des membranes
hybridées avec différentes sondes dans un même tambour de détection si ces sondes sont
marquées avec le même matériel.
Solutions de détection pour sondes marquées à la digoxigénine
Solution Anti-DIG
Solution d'acide maléique:
Solution de blocage:
Solution de réaction:
Solution NBT :
Solution X-Phosphate:
(Boehringer-Mannheim)
(Voir solutions de préhybridation et d'hybridation)
1,5 % (p/v) de poudre dans la solution d'acide maléique.
0,1 MNaCI
50 mM MgCIz
0,1 M Tris-HCl
Nitrobleu-Sel de tétrazolium dissous dans 70 % de
DMF(75mglml)
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate, Sel de toluidine
dissout dans 100 % DMF O,
Pour la détection des sondes marquées à la streptavidine la solution anti-DIG est
remplacée par une solution SA-AP (GATC)
Mode opératoire
Les étapes de la détection dépendent du marquage utilisé pour la sonde.
/
39

10. SEQUENCAGES
L'analyse des séquences de molécules d'acide nucléique est faite selon la méthode de
Sanger (Sanger et al. , 1977). Ces séquençages utilisent la T7-ADN polymèrase (Tabor et
al. , 1987). Un séquençage se fait en cinq étapes:
-Dénaturation de l'ADN à séquencer
La dénaturation permet de séparer les deux brins d'ADN
-Hybridation avec l'amorce
Sur l'ADN monocaténaire qui sert de matrice on hybride une amorce complémentaire
possédant un 3'OH à partir de laquelle l'ADN-polymèrase va polymèriser les quatre
désoxyribonucléotides-triphosphates (dNTP)
-Extension de l'ADN avec terminaison pour spécifier les bases
L'ADN-polymérase permet ainsi de synthétiser alors un brin d'ADN complémentaire à la
matrice. En pratique, on réalise séparément quatre réactions de polymérisation en
introduisant dans chacune d'elles l'un des quatre didésoxyribonucléotides-triphosphates
(ddNTP). Ces didésoxyribonucléotides-triphosphates ne possèdent pas de OH ni en
position 3', ni en position 2' permettant la formation de la liaison phosphodiester suivante.
Leur incorporation à la chaîne d'ADN va donc provoquer la tenninaison prématurée de la
chaîne.
-Séparation du produit sur gel d'électrophorèse
Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide coulée entre deux plaques de verre pennet
de séparer les produits. Les produits de la migration vont être recueillis sur une membrane
se déroulant à une vitesse donnée à la limite des deux plaques de verre.
-Détection du prod uit
La détection d'une membrane de séquences se fait de la même manière que la détection
d'une membrane d'hybridation en tenant compte du produit avec lequel les amorces ont été
marquées.
Séquençage du gène ARNr 168
Le séquençage est fait grâce au kit Amersham et suivant le protocole Amersham
(Amersham hybond broschüre., 1987) légèrement modifié.
Réactifs
Amorces:
La concentration des solutions d'amorces doit être comprise entre 1 et 2 pmolllll.
Le séquençage complet du gène 16S rARN nécessite l'utilisation de 6 à 8 amorces suivant
les souches.
/
41
/

Tableau 11 : Amorces
pour 1e
sequençage comp1et du
gene d'ARNr
16S
Sonde 5'-Séquence-3' *Position
622RII -RAC(CT)(CT)ACCAACTAAGCTAAT-
97K -CTGCTGCCTCCCGTA- 342
607R -ACGTGTGTAGCCC- 1220
610RII -ACCGC(GT)(AG)CTGCTGGCAC- 514
609RII -ACTAC(CT)AGCGGGTATCTAAGT(GT)CC- 784
612RII -GTAAGGTT(CT)T(AGCT)CGCGT- 968
607V -GGGCTACACACGTGC- 1220
606RII -T(AG)ACGG(GC)C(AG)GTGTGTACA-
..
*PosltlOn chez E.coli (Brosius et al., 1981).
1390
Pour la majorité des souches nous nous sommes limités au séquençage des 200 premières
bases. Ce qui permet, dans bien des cas, d'identifier la souche en utilisant seulement
l'amorce 622RlI.
ADNà séquencer
La concentration de la solution d'ADN doit être comprise entre 0,5 et 21lg/1l1.
Les solutions de ddNTP
Les quatre solutions de didésoxyribonuclétides-triphosphates (ddATP, ddCTP, ddGTP, et
ddTTP) sont fournies dans le Kit Amersham mélangés avec la polymèrase.
Huile minérale
L'huile minérale est utilisée pour la réaction de PCR à la place de la paraffine
Solution de formamide
Une solution de formamide permet de stopper les réactions du PCR.
Gel pour électrophorèse
Composition du gel
Solution d'urée* à 4%
Solution 30% polyacrylamide (GATC)
*Composition de la solution d'urée à 4%
Urée ultra pure
10 x TEE*
Eau bidistillée
-Solution TEE dix fois concentrée (l0 x TEE)
Tris lOM
Acide borique lOM
EDTA lOM
./
22 ml
3ml
21 g
4,5 g
18,5 g
./
42

Mode opératoire
Les quatre réactions sont effectuées dans des tubes Eppendorfde 500 Jll.
Tahleau 12 : SI' o utIOns a
,
rea
, 1·
Iser pour le séquençage
Tube A C G T
Solution d'amorce lui 1!-lI lui lui
ddNTP + T7 polymèrase 2!-l1 (ddATP) 2JlI (ddCTP) 2JlI (ddGTP) 2ul (ddTTP)
Solution d'ADN 5!-lI Sul 5!-lI Sul
Huile minérale 50ul 50ul 50!-l1 50ul
-Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur pour le PCR
.
Tahleau 13 . Programme
pour e sequençage du
gene d'ARN16S r
Réaction TempératurelDurée cycles
Dénaturation initiale: 95°C pendant 3mn 1
Hybridation: 50 à 55°C / 30s
Dénaturation: 95°C /30 s 25
Après la PCR additionner 2JlI de solution de fonnamide pour arrêter toute réaction.
Eliminer l'huile minérale. Dénaturer les solutions à séquencer à 90°C pendant 2mn.
Les solutions de PCR aussitôt après dénaturation sont séparées par électrophorèse. Cette
électrophorèse se fait en deux phases:
-première phase de 30 mn a 1200 V
-deuxième phase de 2 à 3 heures a 1750 V avec un courant de 23 mA.
La vitesse de déroulement de la membrane est de 19 cm/heure
L'analyse, la classification des séquences de gènes ARNr 16S et la confection d'arbres
phylogénétiques ont été faites à l'aide du programme LNUX.
./
./
43

estriction, réaction de ligation entre fragment d'ADN et un vecteur capable de se
répliquer,préparation des organismes receveurs et introduction de vecteurs recombinés
dans le cytoplasme d'organismes receveurs.
11.2.1 Extraction d'ADN
L'extraction et la purification d'ADN sont réalisées suivant la méthode de Mannur
(Mannur et al. ,1961, modifié). La titration de la solution d'ADN se fait par la méthode
spectrophotomètrique (voir 7.2)
11.2.2 Fragmentation des acides nucléiques par les enzymes de restriction
L'ADN à cloner doit être coupé en fragments de taille comprise entre 2000 et 6000 bases.
La fragmentation de l'ADN se fait par Sau 3A qui a comme site de reconnaissance la
séquence GATe.
Matériel
ADN de l'organisme donneur
Enzyme de restriction Sau 3A :
Solution de réaction pour Sau 3A :
Phénol/chlorofonne/alcool isoamylique :
EDTA:
Ethanol
Ethanol 70 %
Acétate de sodium:
Solution TE (Voir 6.1.1)
Matériel pour électrophorèse sur gel: (Voir 7.1.)
Mode opératoire
(Boehringer, Mannheim)
(Boehringer, Mannheim)
(25/2411) (v/v/v)
100 mM, pH 8,0
3M,pH4,8
Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml placé dans de la glace, dissoudre 10 Jlg d'ADN dans 90
III d'eau distillée et ajouter à la solution 10 JlI de solution de réaction pour Sau 3A. Bien
mélanger. Partager le mélange précédent dans 9 tubes Eppendorfde 500 JlI numérotés de 1
à 9 en mettant 20 III dans le tube numéro 1 et 10 III dans chacun des tubes restants (2 à 9).
Mettre lU Sau 3A dans le tube numéro 1. Ce qui correspond à une concentration
enzymatique égale à 0,5 U par Ilg d'ADN). On ajoute ensuite 10 III de cette solution au
tube numéro 2 et ainsi de suite, pour avoir une série de dilution.
Incuber les tubes 1 à 9 à 37°C pendant 1heure. Replacer ces tubes dans la glace et ajouter
la solution d'EDTA pour arrêter la réaction (concentration finale 20 mM EDTA)
La concentration enzymatique pour laquelle on obtient des fragments d'ADN de 2000 à
6000 bases sera déterminée par électrophorèse sur gel d'agarose. Hydrolyser partiellement
/'
45

de 500 Jlg d'ADN dans les conditions détenninées ci-dessus. Ajouter la solution d'EDTA
pour stopper la réaction. Extraire l'ADN deux fois de suite avec le même volume de
Phénol/chlorofonne/alcool isoamylique. Centrifuger 1 mn à chaque fois, pour séparer la
phase liquide contenant l'ADN des restes d'enzyme. Ajouter 1/9 volume d'acétate de
sodium et 2,5 volumes d'éthanol absolu pour précipiter l'ADN Incuber à -20°C pendant 1
heure. Centrifuger à 12000 g pendant 30 mn à température ambiante puis éliminer la phase
liquide. Laver le culot avec de l'éthanol à 70 % et sécher sous vide. Resuspendre l'ADN
séché dans 500 III de solution T.E. et conserver à -20°C.
11.2.3 Réaction de ligation entre fragment d'ADN et le vecteur
Réactifs
Vecteur pSUl en solution
Solution d'ADN partiellement hydrolysée
Solution de ligase
Solution de réaction de la ligase
Eau bidistillée stérile
Technique
On utilise un tube Eppendorf de 1,5 ml pour un volume total de réaction égal à 151l\.
Pipetter 1111 pSUl dans le tube puis placer ce tube dans un bain-marie à 45°C pendant 5
mn; cette opération à pour but de linéariser les vecteurs pour faciliter la réaction de
Iigation.
Ajouter ensuite dans le tube:
-10JlI ADN
-1,5Jll solution de Iigase
-1,5Jll de solution de réaction
-1111 eau bidistillée stérile
Le tube est ensuite incubé à 16°C environ pendant 12 heures.
11.2.4 Transformation
La transfonnation consiste à introduire les vecteurs recombinés dans le cytoplasme
d'organismes receveurs. Nous avons utilisé deux méthodes différentes dans cette étude.
11.2.4.1 Transformation de E.coli par électroporation
Solutions
Milieu LB:
Milieu SOC:
Glycérine:
/"
(voir milieux de culture)
(voir milieux de culture)
/"
46

Préparation des cellules compétentes pour électroporation
Ensemencer un litre de milieu de culture LB avec 200 ml d'une préculture de 12 heures sur
milieu LB. Incuber la culture à 37°C sous agitation jusqu'à une densité optique comprise
entre 0,5 et 0,6 à 600 nm. Placer ensuite la culture dans de la glace ou à une température
de 4°C pour la refroidir. Centrifuger à 6000 g, 4°C pendant 10 mn. Laver les sédiments à
deux reprises avec 200 ml d'eau distillée et une fois avec 30 ml de la solution de glycérine.
Incuber ensuite les cellules dans de la glycérine à une température de 4°C. Centrifuger
comme précédemment et resuspendre les cellules dans 400 III de glycérine à répartir par
tube de lOOfl!. On peut directement utiliser ces cellules pour l'électroporation ou les
conserver à -70°e.
Electroporation
Ajouter 10fll de la solution de ligation (voir.) dans un tube contenant 90 ml de cellules
compétentes. Prélever le mélange et l'introduire dans une cuvette pour électroporation
(BioRad, München) préalablement refroidie à O°e.
-L'électroporation est faite à l'aide d'un appareil ("Gene-pulser" de la firme BioRad,
Muenchen). Les paramètres du choc électrique sont 2500 V, 200 Q et 2flF.
Ensemencer les "cellules électroporées" dans 1ml de milieu SOC et incuber 1 heure à
37°C sous agitation pour l'expression phénotypique. Etaler la culture est ensuite sur milieu
LB-agar + Ampicilline et sur milieu pour amylase test + Ampicilline et incuber pendant 12
à 18 heures à 37°e.
10.2.4.2 Transformation de E. coli par choc thermique
Solutions
Milieu Trypton lextrait de levure:
Solution de MgCIz :
Solution de CaClz :
(voir milieux de culture)
100 mM
100 mM
Préparation de cellules compétentes pour choc thermique
Ensemencer 30 ml de milieu Trypton Extrait de levure. Incuber à 37°C en aérobiose
jusqu'à une densité optique de 0,6 (phase logarithmique) à 578 nm. Centrifuger à 5000g,
4°C pendant 10mn et resuspendre les sédiments dans 10 ml de solution de chlorure de
magnésium refroidie. Centrifuger à nouveau à 5000 g, 4°C pendant lOmn et récupérer les
sédiments. Resuspendre les sédiments dans 10 ml de solution de chlorure de calcium
refroidie. Incuber 30 mn dans de la glace. Centrifuger comme précédemment. Resuspendre
les cellules dans 1 ml de solution de chlorure de calcium et conserver à O°C
Transformation
Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 100 nù de cellules compétentes ajouter 2 III
de la solution de ligation. Incuber le mélange 20 mn dans de la glace ou à O°C.
Placer aussitôt le tube dans le bain-marie à 42°C pendant. Replacer le tube 2 mn dans la
glace. Ensemencer ensuite ces cellules dans 900 III de milieu SOC et incuber 90 mn à
37°C sous agitation. Etaler la culture sur milieu LB-agar + Ampicilline et sur milieu pour
amylase test + Ampicilline et incuber à 37°C pendant 12 à 18 heures.
47

RESULTATS
/

1. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DES LEVURES
1.1 Etude morphologique
L'étude de la morphologie et du mode de reproduction de nos souches nous permet de
distinguer trois groupes de levures. Dans le tableau 16 figurent l'origine et le nonbre de
colonies differentes souches isolées.
Ta bleau
16 : Composltlon
de 1a
coIlectLOn de
souches de levures.
Origine Souches Nombre
(UFC/ml)
Echantillon 4 02 15.10+ 4
(Niayes-Diender) 10
07 4. 10 4
11 4. 10 3
Echantillon 5 12 14. 10 4
(Niayes-Diender) 13 1. 10 2
14
15
16
17
Echantillon 7 01 4. 10 4
(Niayes-Cambérène) 05
08
03
Echantillon 8 04
(Casamance) 06
09 5. 10 5
Les souches de levures isolées du vin de palme peuvent être réparties en trois groupes.
Le groupe 1
Le groupe 1 est constitué des souches 01, 02,03,04,06,09, 10, 13 et 15.
Lors du premier isolement sur PEG-agar + chloramphénicol ces souches se présentent
sous la forme de colonies de couleur blanchâtre à beige, d'aspect poudreux. Elles sont plates
et présentent des ornementations en surface. La taille atteint 4 mm au bout de 12 heures. La
croissance est rapide et les colonies peuvent occuper toute la surface de la gélose en 72
heures. La croissance de ces colonies et encore possible à température ambiante.
Sur milieu liquide elles donnent une voile blanchâtre.
./ ./
48

Au microscope on peut noter la présence de cellules plus ou moins allongées avec
multiplication végétative par bourgeonnement latéral et surtout par scissiparité pour donner
des filaments mycéliens et des arthroconidies. Sur des préparations faites à partir de vieilles
cultures on peut observer des spores imparfaites et des arthroconidies. Ces souches ayant
deux modes de reproduction végétative (scissiparité et bourgeonnement) appartiennent
généralement au genre Trichosporon. Ces présomptions devraient être confirmées par l'étude
des caractères biochimiques.
Le groupe 2
Le groupe 2 est constitué des souches 05, 07 et 08.
Les colonies sont très petites après 24 heures de croissance sur milieu PEG-agar +
chloramphénicol, elles ont l'aspect de colonies bactériennes. Elles sont blanches, arrondies
avec un diamètre compris entre 2 et 3 mm.
Au microscope on observe des cellules allongées en division. La scissiparité semble
être le seul mode de reproduction. La présence de spore, de cellule bourgeonnante ou de
mycélium n'a pu être décelée.
On note une forte production de gaz sur bouillon PEG.
Ces souches qui ont la scissiparité comme seul mode de reproduction végétative
devraient appartenir au genre Schizosaccharomyces.
Le groupe 3
Le troisième groupe est constitué des souches 11, 12, 14, 16 et 17.
On observe des colonies blanches, convexes, isolées ou jumelées. Les colonies isolées
sont bien arrondies de diamètre compris entre 2 et 4 mm.
A l'observation microscopique on découvre des cellules arrondies qui se reproduisent
par bourgeonnements multilatéraux.
Sur les préparations faites à partir de cultures âgées on note aussI la présence
d'ascospores haploïdes et l'absence de mycélium.
On observe une forte production de gaz sur bouillon PEG.
Pour ces souches les résultats de l'étude morphologique orientent nos présomptions
vers les genres Saccharomyces surtout, Pichia et Kluyveromyces.
1.2 Etude des caractères biochimiques des levures
Dans le tableau 17 sont représentés les résultats de tests biochimiques.
Ces tests sont réalisés dans le but d'effectuer des identifications à l'aide des clefs
dichotomiques de Deak (Deak et al., 1992 ) et celles de Payne (payne et al., 1990).
/'
49

TABLEAU 17 : Résultats des tests biochimiques chez les levures.
Assimilation
Souches
.05 + - - d - ­
.07 + - - d - ­
.08 + - - d - -
.11
+ + + +
.12
+ +
.16
+ + +
.01 + + - nd + + + nd ­
.09 + + - nd + + + nd ­
.15 + + - nd + + + nd -
d= crOlssance lente, nd = non détenruné.
+ +
+ +
+ +
+ + +
+ + +
+ + +
+ +
+ +
+ +
Les membres du groupe 1 sont uréase positive, ils résistent à une concentration de
cyclohéximide égale à 0,1% et peuvent croître sur plusieurs substrats mais ne fennentent
aucun de ces substrats.
Les souches du groupe 2 sont également uréase positive et résistent à une concentration
de 1% d'acide acétique. Elles sont osmotolérantes (croissance sur PEG 60% glucose). Elles
fermentent le glucose et n'utilisent aucun des substrats étudiés comme unique source de
carbone ou d'azote pour leur croissance. Ces résultats confirment l'appartenance de ces
souches au genre Schizosaccharomyces.
Les souches du groupe 3 fermentent activement le glucose elles peuvent utiliser les
nitrates comme unique source d'azote. Elles sont capables d'utiliser le D-xylose et le D­
Glucuronate comme unique source de carbone mais n'assimilent ni la cellobiose, ni le lactate.
Ces résultats, analysés à l'aide des clés dichotomiques de Deak (Deak et al., 1992 ) et de
Payne (Payne et al., 1990), permettent de les identifier comme appartenant au genre
Saccharomyces.
1.3 Utilisation de la FTIR comme technique d'identification
La comparaison des profils FTIR des souches à identifier avec ceux d'une banque de
données ont permis de classer nos souches de levures dans des arbres phylogénétiques.
Ces arbres phylogénétiques sont présentés sur les figures 7,8 et 9.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
50

1.3 Utilisation du PCR comme technique d'identification
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Figure 10 : Profils obtenus après amplification de l'ADN des souches de levures par amorce
arbitraire M13. Lignes 1, 8 et 15 = ADN marqueurs standard Hind III. Lignes 2, 3 et 4 =
respectivement souches Schizosaccharomyces sp 05, 07 et 08. Lignes 5, 6 et 7 = souche
Saccharomyces sp isolée du «sourdough» allemand. Lignes 9, 10, 11, 12 et 13 =
Saccharomyces sp. du vin de palme sénégalais (respectivement souches 017; 014; 011 ; 012;
et 016). ligne 14 = Souche Kluyveromyces sp.
La technique du PCR nous permet ainsi, en comparant les profils, de confirmer que les
souches 017,014,012 et 016 appartiennent au même groupe que la souche 011 donc sont des
Saccharomyces cereviseae, et que les souches 05, 07 et 08 l'appartiennent à un même genre
qui doit être Schizosaccaromyces.
Trois genres de levures ont donc été isolés de nos échantillons :
Saccharomyces cereviseae est la plus abondante dans le vin de palme parmi ces levures
est son identification à l'aide de la comparaison des profils FTIR (figure 8) est très claire.
Les souches Schizosaccharomyces sont plutôt identifiées à partir des traits
morphologiques et des caractèristiques biochimiques. Ces souches n'assimilent ni le maltose,
ni le D-Glucuronate. Ces résultats les apparentent plus à Schizosaccharomyces japonicium
qu'aux deux autres espèces de ce genre qui sont Schizosaccharomyces pombe et
Schizosaccharomyces octoporus.
53

Les espèces du genre Trichosporon sont généralement connues pour leur faible pouvoir
fermentaire. Celles que nous avons isolées de nos échantillons ne fermentent pas le glucose.
/' /'
54

2. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DES SOUCHES BACTERIENNES
2.1 Utilisation de sondes génétiques
2.1.1 Etude préliminaire
Ta bleau
18 Forme,
t[ype
fiermentalre
et presomptIOns chez es souehes Isolées
Souche Nombre Métabolisme Forme/(Présomptions)
(UFC/ml)
273 6.10 6
290 10.10 5
282 1.10 8
283 3.10 6
216 3.10 6
219 2.10 5
260 1.10 5
202 1.10 6
238 5.10 5
278 1.10 7
222 1.10 7
211 3.10 6
291 1.10 8
206 3.10 6
285b 1.10 8
285j 1.10 8
234 4.10 7
235 4.10 7
243 1.10 6
289 4.10 4
294 1.10 7
266 7.10 5
265 1.10 6
281 8.10 7
275 32.10 6
Bacilles
(lactobacillus : Betabacterium)
HETERO-
FERMENTAlRE Coccobacilles
(Gaz +) (Lactobacillus : Betabactérium
ou Leuconostoc)
Cocci (Leuconostoc)
Bacilles
(Lactobacill us : Streptobacteriwn
HOMO- ou Thermobacterium)
FERMENTAIRE
(Gaz -)
CoccobaciIles
(Lactobacillus :Streptobacterium
ouThermobacterium Streptocoques
ou Pediocoques)
Cette identification commence par une étude préliminaire qui s'intéressera aux
caractères morphologiques et biochimiques. Cette étude nous guidera dans le choix des
sondes à tester. Le tableau 18 présente les résultats du dénombrement des colonies dans 1ml
de vin de palme, ceux de l'observation microscopique et de la production de gaz sur bouillon
MRS qui nous permettent d'avoir des présomptions sur le type de métabolisme et sur les
positions taxonomiques des souches.
Les souches testées dans cette étude, selon les études préliminaires, appartiendraient
aux genres Lactobacillus (homofermentaires et hétérofermentaires), Pediococcus et
/ /
55

Leuconostoc. Au vu de ces résultats, il est nécessaire d'utiliser plusieurs sondes pour
identifier nos souches.
2.1.2 Hybridation avec des sondes génétiques
A
B
c
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
202 206 209a 209b 210 211 216 219 222 234 235 238
243 255 260 266 273 275 278 281 282 283 285b 285a
289 290 294 291 Lb.fe Lb pl Lb pe
Figure 11: Ordre des ADN à tester sur la membrane;
Lbfe= ADN de Lactobacillusfermentum, Lbpl= ADN de Lactobacillus plantarum,
Lbpe= ADN de Lactobacillus pentosus
A.
B
c"·
4 5 6 8
r -
Figure 12: Hybridation avec sonde universelle (uni)
A
B
c'
2 3 4 5 6 7 8
-"
9 la 11
" ,
12
9 10 11 12
Figure 13: Hybridation avec Lbpe (Sonde pour Lactobacillus plantarum etpentosus)
A
B
co,
2 3 8 9 10 11 12
Fieure 14: Hybridation avec Lbfe (sonde pour Lactobacillusfermentum )
/
/
56

./
L'ensemble des résultats de l'hybridation avec les sondes génétiques est résumé dans le
tableau 19.
Tableau 19 : Résultats de l'h bridation avec sonde
SOUCHES HYBRIDATION AVEC SONDE
TESTEES
Uni Lba Lbb Lbfe Lbl Lb e
206
234
281
289
294
285b
285j
273
282
283
290
222
202
209a
209b
210
211
216
219
238
243
255
260
266
275
Lac. Pentosus LTH482
Lac.plantarum LTH232
Lac. fermentum DSM2üü52
Lac. Lindneri DSM2459ü
Lac. Amylophilus LTH5ü3
Lac. Brevis DSM2üü54T
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Uni=sonde universelle, Lba=sonde pour Lactobacillus amylophilus, Lbb=sonde pour
Lactobacillus brevis, Lbfe=sonde pour Lactobacillus fermentum, Lbl=sonde pour
Lac/obacillus lindneri, Lbpe=sonde pour Lac/obacillus plan/arum et Lactobacillus pen/osus.
Pour l'hybridation avec la sonde universelle seule la souche 275 n'a pas donné de
résultat positif. Ceci est certainement dû à un mauvais traitement de l'ADN avant
l'hybridation. Ce résultat peut s'explique aussi par la croissance lente et faible de cette souche
dans nos conditions de culture, ce qui entraîne une trop faible quantité d'ADN lors de
l'extraction.
./
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
57

Lactobacillusfermentum
Les souches 273 et 282 ont des séquences identiques à celle de Lactobacillusfermen/um.
Lactobacillus casei
La souche 235 a exactement la même séquence que Lac/obacillus casei.
Lactobacillus curvatus lLactobacillus sake
La souche 266 s'apparente aux Lac/obacillus curva/us et à Lac/obacillus sake. Les
séquences de ces souches diffèrent dans la région de l'hélice 6 par une seule base en position
93.
Donc les séquences au niveau de la région de l'hélice 6 du gène ARNr 16S pennettent
difficilement de conclure à l'identification de la souche 266 à Lac/obacillus curva/us ou
Lac/obacillus sake. Ces deux espèces ont des séquences très proches. Cependant la
morphologie des bacilles (Au microscope on observe des bacilles pairs recourbés, fonne
caractéristique de Lac/obacillus curva/us) et la similarité observée entre les profils d'ADN
amplifiés par amorce arbitraire des souches 266 et Lac/obacillus curva/us TMW 1.2 (figure
15) plaident en faveur de cette dernière.
Lactobacillus brevis
La séquence de la souche BI diffère de quatre bases de celle de la souche Lac/obacillus
brevis prise comme référence. La souche BI devrait être une Lac/obacillus brevis.
Ce résultat confinne 1'hétérogénéité génétique constatée chez cette espèce.
Lactobacillus plantarum
La séquence du gène d'ARN ribosomale 16S de la souche 234 est semblable à celle de
Lac/obacillus plan/arum. A partir de ce résultat on peut identifier les souches 234 206, 294,
289,281, 285b, 285j, 284, 294, 287j, 288j et 276 comme étant des Lac/obacillus plantarum.
-Profil plasmidique des souches de Lac/obacillus plan/arum
Le profil plasmidique pennet aussi de caractériser les souches de Lac/obacillus
plan/arum. Ces profils sont présentés sur les figures 18 et 19.
Bases paires
564
831
947
1375
2 3 4 5
Figure 18 : Profils plasmidiques des souches de Lactobacillus plantarum. 1:271,2 : 281,
3: 288j, 4 : 289, 5 : 294.
./
60

La souche 286 a un profil different de celui des autres pediocoques isolés de nos
échantillons.
564
831
947
1375
1584
2027; 1904
4268;3530
5148;4973
21226
Bases paires
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figure 21 : Comparaison des profils obtenus après amplification de l'ADN par amorce
arbitraire chez les souches de bactéries lactiques du genre pediococcus. Lignes 1, 6 et 11=
HlND III. 2: Pediococcus dextranicus, 3: Pediococcus Pentosaceus, 4: Pediococcus
acidilactici, 5 : 286, 7 : 272, 8: 267b, 9 : 270, 10 : 280.
Lorsqu'on analyse les corrélations entre ces différents profils, on s'apperçoit que la
souche 286 est très proche de Pediococcus Pentosaceus alors que les autres souches forme
un groupe plus ou moins équidistant des espèces Pediococcus acidilactici, Pediococcus
Pentosaceus et Pediococcus dextranicus (figure 22).
30 40 50 60 70 80 90 100
1 1 1 l " ' r 1 l " ! " " 1 1 l " 1 l " l , 1 1 1 Il 1 1 l " l , 1 1 1 1 1 Il " l " l " Il 1 l " 1 1 l " " 1 1 1 1 1 1 Il! ri
,---------------Pediococcus spec. PW267b
r--_-f---------l------------pediococcus spec. PW270
'---------------------Pediococcus spec. PW280
Pediococcus penlosaceus OSM20336T
Pediococcus spec. PW286
Pediococcus dextranicus OSM20335T
'----- Pediococcus acidilaclici OSM20333T
L.--------------------Pediococcus spec. PW272
Figure 22 : Corrélation entre les souches du genre Pediococcus sur la base du PCR
fingerprinting.
63

Sous-groupe 3
Le gène ARN ribosomale 16S de la souche 209b est identique à celui des souches 226,
218,245,275,276 et 278 de la position 66 à la position 126 (hélice 6 ). Il diffère des autres
Leuconostocs au niveau des positions 21 et 32. Nous avons GAUGAA-C-A-- chez la
souche 209b alors que pour tous les autres Leuconostocs connus cette région est conservative
et a pour séquence: CU-GGCUCAGGA. Cette souche constitue à elle seule un sous-groupe.
Sous-groupe 4
Ce sous-groupe comprend les souches 207, 209a et 238. Au niveau de l'hélice les
séquences diffèrent de celles de Leueonostoe mesenteroides et de Leueonostoc
pseudomesenteroides respectivement par cinq bases et trois bases. Ces souches semblent
plus proches de Leueonostoe laetis et de Leueonostoe amelibiosum.
Sous-groupe 5
Ce sont les souches 202 et 260. Leurs séquences diffèrent de celles des membres du
sous-groupe 4 par une seule base. Ces souches semblent très proches de Leueonostoe
amelibioswn. Mais la comparaison de la séquence complète avec celle de Leueonostoe
amelibiosum montre un grand nombe de différences.
Gène 16S de Leuconostoc sp. 260
GGA UGA ACG CUG GCG GCG UGC CUA AUA CAU GCA AGU CGA ACG
61 C-G CAG C - - - GA GAG GUG CVU GCA CCU VUC - - - - - - - - - - -1\ AGC GAG - UG GCG AAC
121 GGG UGA GUA ACA CGU GGA UAA CCU CGU UCA AGG CUG GGG AUA ACA UUU GGA AAC AGA UGC
181 UAA UAC CGA AUA AAA CUU AGU AUC GCA UGA UAU AAA GVU AAA AGG CGC - UA CGG CGU CAC
2·1I CUA GAG AUG GAU CCG CGG UGC AVU AGU UAG VUG GUG GGG UAA AGG CUU ACC AAG ACA AUG
301 AUG CAU AGC CGA GUU GAG AGA CUG ACC GGC CAC AUU GGG ACU GAG ACA CGG CCC AAA CUC
361 CUA CGG GAG GCU GCA GUA GGG AAU CVU CCA CAA UGG GCG CAA GCC UGA UGG AGC AAC GCC
421 GCG UGU GUG AUG AAN GCU VUC GGG UCG UAA AGC ACU GVU GUA UGG GAA GAA NNN NNN NNN
481 NG GGA A - U GAU UUU AGU VUG ACG GUA CCA UAC CAG AAA GGG ACG GCU AAA UAC GUG CCA
SH GCA GCC GCG GUA AUA CGU AUG UCC CGA GCG VUA UCC GGA UUU AUU GGG CGU AAA GCG AGC
601 GCA UAC GGU UGA VUA AGU CUG AUG UGA AAG CCC GGA GCU CAA CUC CGG AAU GGC AVU GGA
661 /\AC UGG VUA ACU UGA GUG VUG UAG AGG UAA GUG GAA CUC CAU GUG UAG CGG UGG AAU GCG
721 UAG AUA UAU GGA AGA AGA CCA GUG GCG AAG GCG GCU UAC UGG ACA NCA CUG ACG UUG AGG
781 CUC GAA AGU GUG GGU NGC AAA CNG GAU UAG AUA CCC UGG UNG UCC ACA CCG UAA ACG AUG
841 AAU NCU AGG UGU UAG GAG GUU UCC GCC UCU UAG UGC CGA ACG UAA CGC Nl\fN NNN NNN NNN
901)\.fNN NNN NNN NNN CGA CCG CM GGU UGA AAC UCA AAG GAA UUG ACG GGG ACC CGC ACA AGC
961 GGU GGA GCA UGU GGU VUA AUU CGA AGC AAC GCG AAG AAC CUU ACC AGG UCU UGA CAU C - C
1021 UUU GAA GCU UUU UA - GAG AUA GAA GUG VUC - UC UUC GGA GAC AAA GUG ACA GGU GGU GCA
1081 UGG UCG UCG UCA GCU CGU GUC GUG AGA UGU UGG GVU AAG UCC CGC AAC GAG CGC AAC CUU
1141 AUU GVU ANU UGC CAG CAU UCA GUU GGG CA.
Figure 26: Alignement de la séquence compléte du gène d'ARNr 16S chez Leueonostoe_sp.
260. Les symboles sont les mêmes que ceux sur la figure 17.
Sous-groupe 6
Ce sous-groupe renferme les souches 227, 250 et 251. Dans la région de l'hélice 6 les
séquences sont identiques à celle de Leueonostoefruetosus.
L'étude morphologique a révélé que les souches de ce sous-groupe peuvent se présenter
sous forme de bâtonnets longs et très fins contrairement à Leueonostoe fruetosus et aux
autres membres connus du même genre.
67

La comparaison des séquences complétes des souches du sous-groupe 6 avec celle de
Leuconostocfructosus montre une vingtaine de bases différentes.
Gène 16S de Leuconostoc sp. 227
1 AGU UUG AUC AU- AGC UCA GGA UGA ACG CUG GGC GGC UGC CUA AUA CAU GCA AGU CGU ACG
61 A-A CAG C - - - - - -GG AAA GUG CUU GCA CUU UCC - - - - - - - - - - - A AGU AAG -UG GCG AAC
121 GGG UGA GUA ACA CGU GAA UAA CCU ACC UCA AAG ACU GGG AUA ACC AUU GGA AAC AGU GAC
181 UAA UAC CGG AUA AAA CCC AGU AGC ACA UGC UAC AAG GUU AAA AGC UGC -GU UUG CAG CGC
241 UUU AAG AUG GAU UCG CGG UGC AUU AGU UAG UUG GUG AGG UAA AGG CUC ACC AAG ACA AUG
301 AUG CAU AGC CGA GUU GAG AGA CUG ACC GGC CAC AUU GGG ACU NAG ACA CGG CCC AAA CUC
361 CUA CGG GAN GCU GCA GUA GGG AAU CUU CCA CAA UGG GCG CAA GCC UGA UGG AGC AAC GCC
421 GCG UGU GUG AUG AAG GCU UUC GGG UCG UAA AGC ACU GUU GUA UGG GAA GAA CGG GUU UAA
481 GAG GAA A-U GCU UAA GCA GUG ACG GUA CCA UAC CAG AAA GGG ACG GCU AAA UAC GUG CCA
541 GCA GCC GCG GUA AUA CGU AUG UCC CGA GCG UUA UCC GGA UUU AUU GGG CGU AAA GCG AGC
601 GCA GAC GGU UCG AUA AGU CUG AAG UGA AAG CCC ACA GCU CAA CUG UGG AAU GGC UUU GGA
661 AAC UGU CGA ACU UGA GUG CAG UAG AGG UAA GUG GAA CUC CAU GUG UAG CGG UGG AAU GCG
721 UAG AUA UAU GGA AGA ACA CCA GUG GCG AAG GCG GCU UAC UGG ACU GCA ACU GAC GUU GAG
781 GCU CGA AAG UGU GGG UAG CAA ACA GGA UUA GAU ACC CUG GUA GUC CAC ACC GUA AAC GAU
841 GGA UAC UAG UUG UUA GAG GGU UUC CGC CCU UUA GUG ACG AAG CAA ACG CAU UAA GUA UCC
901 CGC CUG GGG AGU ACG ACC GCA AGG UUG AAA CUC AAA GAA AUU GAC GGG GAC CCG CAC AAG
961 CGG UGG AGC AUG UGG UUU AAU UCG AAG CAA CGC GAA GAA CCU UAC CAG GUC UUG ACA UC-
1021 CUU UGA AGG UAC UA- GAG AUA GUG CUG -UC UUC UUC GGA AGC AAA GUG ACA GGU GGU GCA
1081 UGG CCG UCG UCA GCU CGU GUC GUG AGA UGU UGG GUU AAG UCC CGC AAC GAG CGC AAC CCU
1141 UAU GUU UAG UUG CCA GCA UUC AGU UGG GCA CUC UAG ACA GAC UGC CGG UGA CAA ACC GGA
1201 GGA AGG CGG GGA CGA CGU CAG GUC AUC AUG CCC CUU AUG GUG AAG GUG AGC GAA UCU CUU
1261 AAA GUA CGU CUC AGU UCG G N NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN .AA UCG CUA
1321 GUA AUC GCG GAU CGA GCA UGC GGC GGU GAA UAC GUU CCC GGG UCU UGU ACA CAC CGC CCG
1381 UCA CAC CAU GGG AGU UGG UAA UGC CCA AAG CCG GUG GCC UAA CC- UUC G-G GAA GGA GCC
1441 GUA UAA GGC AGG ACU GA- UGA CUG GGG UGA AGU CGU AAC AAG GUA GCC GUA GGA GAA CCU
1501 GCG GCU GGA UCA CCU CCU UU
Figure 27: Alignement de la séquence complète du gène d'ARNr 16S chez Leuconostoc_sp.
227. Les symboles sont les mêmes que ceux sur la figure 17.
peR fingerprinting des leuconostocs
La comparaison des profils obtenus après électrophorèse des produits résultants de
l'amplification de l'ADN avec une amorce arbitraire (figure 28) permet de faire plusieurs
constats.
Les souches 2ü9b, 218, 275, 278 et 292 ont des profils semblables.
Les souches 245, 261,226 et 228 présentent des profils assez proches entre.
Il n'y a aucune identité entre les profils des Leuconostocs isolées de nos échantillons et
celles des souches de Leuconsotocs connues.
La souche 227 et Leuconostoc fructosus n'ont pas de profils identiques ce qui rend
nécessaire une comparaison des séquences ARNr 16S complètes de ces deux souches.
./
68

Etude de caractéristiques biochimiques
Tableau 25 : Pouvoir fennentaire les souches de « bactéries non lactiques ».
Souches
.Fermentation
691 + + + + + d + + + + d d + + + + +
291 - + + + + + nd - + + + + +
244 -
.018 w + + + +d=
Fermentation tardive (après plus de 48 heures d'incubation), nd= non déterminé.
Gluconobacter sp. 018 et Heliotrix sp. 244 sont les seules souches gram négatif isolées
du vin de palme. Leur nombre devient très important après 48 heures de fennentation. La
souche Heliotrix sp. 244 semble être caractérisée par un équipement enzymatique très pauvre,
de tous les hydrates de carbone testés seul le glucose est fennenté.
Des activités amylolytiques sont décelables chez Paenibacillus sp. 691 et chez
G!uconobacter sp. 018.
En conclusion, le groupe des bactéries non lactiques est composé de souches
appartenant aux genres Staphylococcus, Bacillus, Paenibacillus, Gluconobacter et Heliothrix.
Ces bactéries non lactiques isolées de nos échantillons forment un groupe assez hétérogène.
Cette hétérogénéité est visible aussi bien au niveau du spectre de la fennentation des sucres
qu'au niveau des profils des ADN amplifiées arbitrairement.
Et pour l'identification des bactéries, en général, l'utilisation de sondes génétiques
combinée à la PCR a pennis de déterminer un grand nombre de souches avec des économies
de temps considérables. Cette méthode nécessite tout de même des études morphologiques et
biochimiques préalables pouvant guider dans le choix des sondes. La réussite d'une telle
analyse dépend pour beaucoup de l'existence de sondes hautement spécifiques déduites à
partir des séquences de nucléotides des régions variables des gènes ARNr 16S et 23S.
C'est une approche combinant l'analyse des séquences de l'hélice 6 du gène ARNr 16S
combinée au PCR fingerprinting et à l'étude du spectre fennentaire et des traits
morphologiques qui nous a permis d'identifier la majorité de nos souches et souvent jusqu'à
la sous espèce.
,/
75

Bases paires
3530
4268
5148;4973
2 3
Figure 39: Electrophorèse des fragments d'ADN de taille comprise entre 1114 bp
et 4268 bp (Lignes 2). Lignes let 3 : ADN standard Hind II etVIII respectivement.
3.1.3 Ligation de l'ADN avec pSUl et transformation de E.coli HBI01.
L'ADN de Paenibacillus sp. 691 est ligué au vecteur pSUl. Ces vecteurs pSU1+ADN
de Paenibacillus sp. 691 vont servir à la transformation de E coli HE101. Les souches E coli
HE101 ayant reçu le vecteur pSU1 deviennent résistantes à l'ampicil1ine. Il ne restera alors
qu'à tester l'activité amylolitique des cellules Ecoli HB101 sur milieu solide contenant
l'amidon comme unique substrat carboné avec l'ampicilline comme agent sélectif.
Recherche de clone E. coli HBlOl Amylase positive
Plus de 500 colonies E coli HE 101 transformées avec le vecteur pSU1 plus ADN
Paenibacillus sp. 691 sont testées. Une colonie positive a été détectée.
Figure 40 : Photo de clones après croissance (48H d'incubation à 37°C) sur milieu sélectif
pour tester l'activité amylolytique. La flèche indique une colonie positive détectée grâce à la
présence d'un halo clair (virage au jaune du pourpre de bromocrésol) autour de la colonie.
78
./

./
Le plasmide recombinant (vecteur pSU 1) à été isolé de ces souches E. coli HB 101
amylase positive (figure 41).
Bases paires
3530
4268
5148; 4973 '
21226
Figure 41 : Electrophorèse de l'ADN du plasmide isolé à partir d'un clone
E. coli HE 101 amylase positive (Lignes 2 et 3). Ligne 1= HIND III.
3.1.4 Amplification et Isolement d'un fragment de gène d'amylase par peR
La production d'amplificats avec les amorces AMY 1V et AMY 1R est testée sur des
ADN (génomiques et plasmidiques) provenant de clones amylase positive et de souches
utilisées comme référence. Les produits obtenus sont photographiés après électrophorése sur
gel d'agarose. Lactobacillus amy!ovorus LTH 503 et une souche de Lactobaci/!us
amy!ophilu.... ont été testés, au préalable, pour vérifier la spécificité des amorces AMY l V et
AMY IR. Les ADN des souches Lactobacillus amy!ovorus LTH 503 et Lactobacillus
amylophilus sont amplifiées par les amorces AMY 1V et AMY 1R. La taille des fragments
obtenus est d'environ 1000 bp (figure 42).
Bases paires
21226
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figure 42: Produits obtenus après amplification par les amorces AMY 1V et AMY IR
Ligne 1 et 12 : ADN standard HIND III. 2: Lactobacilfus casei 235, 3 : Lactobaciffus brevis
BI, 4: Lactobaciffus curvatus 266, 5:Staphylococcus sp 291, 6: souche 244, 7 :
Gluconobacter sp., 8 : souche 266, 9 : Lactobacilfus fermentum 273, 10 : souche 229, 11 :
Lactobaciffusfermentum 282.
79

Bases pair
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Figure 43 : Produits obtenus après amplification par les amorces AMY 1V et AMY IR
Ligne 1 et 13: ADN standard IDND III. 2: Lactobacillus amylovorus LTH 503, 3:
Lactobacillus amylovorus TMW 1.88, 4: Lactobacillus amylovorus TMW 1.88, 5 :
Lactobacillus amylophilus, 6: 691(Lysat enzymatique d'ADN), 7 : 691 (Ultrasonat d'ADN), 8:
E.coli HB101, 9: ADN E.coli HBI0l(Amyl+), 10 : ADN E.coli HBI0l, 11 : Plasmide E.coli
HB101(Amyl+), 12: Plasmide E.coli HB101(Amyl+).
Des ADN de souches sans pouvoir amylolytique ont été également testées, certaines de
ces souches peuvent donner des fragments d'ADN lorsque la température d'hybridation est
basse. C'est le cas des souches Lac/obacillus plan/arum LTH 1.25 et 206. Ces fragments sont
de taille beaucoup plus grande que ceux obtenus avec les souches amylase positives. Par
ailleurs, lorsqu'on augmente la température d'hybridation de 3°C les souches Lac/obacillus
plan/arum LTH 1.25 et 206 ne donnent plus de fragment. Ce résultat nous permet de
considérer les amorces AMY 1V et AMY IR comme étant spécifiques pour certains gènes
d'amylase.
Séquence de l'amplificat isolé par peR.
1COO TTC AAA CTT CAC CTG TTA ATG AAG TTA AAG TTG GAA ATA GCG GGT CTA AGT CAT TAA
61ATA ACT OOT ATT GGC TAT ATC AGC CAA CTA AAT ATA GTA TTG GTA ACT AIT ATT TAG GAA
121COO AAG CTG AAT TTA AGT CAA TGT GCG CTG CTG CTA AAG AAT ATA ATA TCA GGA TCA TTG
181TCG ACG CAA CTC TGA ATG ATA CAA CAA GTG AIT ATA GTG CAA TTT CGG ATG AAA TTA AAA
UIGTA TTC CAA ATT GGA CAC ATG GTA ACA AAC MA TTT CGA ATT GGA GTG ATC GTG AAG ATG
JOITTA CTC AAA ATT CGT TGT TAG GTT TAT ATG ATT OOA ATA CTA AAA ATT CTC AAG TTC AAG
36lTTC AGA CGT ATT TGA AGA ATT ATT TGG AAC GCT TGA TIT CTG ACG GAG CTT CAG GCT TTC
421GTT ATG ATG CAG CTA AGC ATA TTG MC TTC CAA GTC MT ATG ATG GCA GCT ATG GCA GCA
48lATT TCT GGC CAA ATA TTA CTG ATA ATG GGT CTG MT TTC AGT ATG GTG MG TIT TGC AGG
S41ACT CGA TTT CM MG AAT CAG ATT ATG CTA ATT ACA TGA GTG TTA CAG CTT CAA ATT ACG
60lGCA ATA CGA TTC GCA ATG CGT TM AGG ATC GTG ATT TTA CCG CM GTA CTT TGC AGA ATT
66lTCA ACA TCA GTG TTC CAG CTT CTA MT TAG TM CTT GOG TCG AAT CGC ATG ATA ATT ATG
nlCTA ACG ATG ATC MG TIT CGA CTT GGA TGA ATA ATA GTG ATA TTA MT TAG GCT GOG CTG
78lTTG TTG CIT CGC GTT CTG GTA GTG TTC CGC TGT TCT TTG ACC GTC CAG TTG ATG GTG GTA
84IATG GTA CTC GGT TCC CTG GCA GTT CAG AAA TTG GTG ATG CTG GCA GCA GTT TGT ATT ATG
90lATA MG CAG TTG TAG CTG TTA ATA MT TCC ATA ATG CAA TGG CTG GTC AAT CTG
Figure 44: séquence de l'amplificat obtenu avec Gluconobacter sp. 018. Les symboles sont
les mêmes que ceux sur la figure 17.
./
80

On a pu comparer cette séquence avec d'autres séquences de gènes connus, les séquences les
plus proches sont:
-a-amylase de Bacillus subtilis (EC 3.2.1.1) : 647 bases homologues.
-a-amylase de drosophile: 118 bases homologues.
-Cyclomaltodextrine glucanotransférase : 87 bases homologues.
./ ./
81

DISCUSSI N
/'

2. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DES BACTERIENNES
2.1 Utilisation de sondes génétiques
Cette méthode nous a permis d'identifier jusqu'au niveau de l'espèce une partie des
souches. Le temps requis pour ces déterminations ne dépasse pas quarante huit heures et il est
possible de tester en même temps un nombre important de souches et de sondes. Trente deux
souches ont été testées sur huit sondes dans cette étude.
Il existe plusieurs préalables pour l'application de cette méthode.
Il faut une hybridation de l'ADN à tester avec une sonde universelle déduite de régions
conservées des gènes d'ARNr 16S et 23S. Ces techniques d'hybridation utilisées dans cette
étude nécessitent des quantités d'ADN relativement importantes. Il faut environ 700 Ilg
d'ADN pour obtenir une hybridation avec 2 Ilg d'une sonde homologue (Delay et al., 1970).
Les sondes utilisées doivent être hautement spécifiques et la recherche de ces sondes
passe nécessairement par une comparaison des séquences complètes des gènes d'ARNr 16S
et 23S. Les sondes existantes ne permettent pas de distinguer Lactobacillus plantarum et
Lactobacillus pentosus. Selon certains auteurs (Collins et al., 1991), les gènes d'ARNr 16S
de ces deux souches, d'où est déduite la sonde Lbpe, ont au moins 99% de similarité. Et du
point de vue caractéristiques biochimiques seule la fermentation du glycérol permet
d'identifier ces deux espèces.
L'hybridation avec les sondes génétiques est surtout utilisée conune moyen de
diagnostic des produits alimentaires et biologiques en général.
2.2 Analyse des séquences du gène ARNr 16S
Dans cette étude nous avons opté pour une approche faisant appel à l'étude de
caractéristiques biochimiques comme la production de bactériocine, la formation
d'exopolysaccharides au cours de la croissance, l'étude du spectre fermentaire, des profils
plasmidiques et la comparaison des séquences des gènes ARNr 16S.
Ce sont ces séquences des gènes ARNr 16S et 23S qui sont également à la base de la
taxonomie moléculaire. La comparaison de ces gènes chez différentes espèces a permis de
dresser des arbres phylogénétiques
Nous avons constaté dans cette étude qu'une comparaison des séquences de la région de
l'hélice numéro 6 (figure 46) permet une identification de nos souches. D'ailleurs la grande
majorité des sondes génétiques utilisées pour la détection des bactéries lactiques est conçue à
partir de séquences de cette région.
Ce résultat est important à souligner car il permet d'éviter le séquençage complet des
gènes 16S ARNr donc d'économiser du temps et des réactifs. Par exemple une seule amorce
est utilisée au lieu de huit amorces ou plus.
./ ./
84

16S rRNA
B. globispOrllS
Sla. al/reus
Sla. calïlOSUS
B. slIbtilis
B. lichelliformis
B. anthracis
23S rRNA
Therniotoga
Lisleria
B. globisporus
Sra. al/reus
Sto. calïlosus
B. sllbtilis
B lichelliformis
B. alllhracis
. LactocOCCUS
Str.lhermophilus
Sir. QI'alis
Lb. delbrtteckii
B. alcalaphilus
B. stearOlhermophilllS
C. ryrobutyriclIl1l
C. botl/lillum
Peptococcl/s
HeliobaCierillnJ
Pectillatus
LaClOcOCCliS
Str. Ihermophill/s
Str. QI'alis
Lb. delbrl/eckii
B. alcalophilllS
B.sp slrain PS3
1-':::._--.... B. stearOlhermophilus
C. tyrobwyricllllI
Peplococc/lS
Heliobaueril!11J
PeuinaillS
C. bOlltlinum
Figure 47 : Arbre phylogénétique des bactéries gram positif à faible pourcentage GC sur la
base des séquences des gènes ARNr 16S et 23S (Juke el al., 1969).
Sur la base de l'analyse de l'hélice 6 du gène 16S ARNr il est possible de faire un
certain nombre de remarques.
-Chez Lactobacillus et Pediococcus
Les souches du genre Lactobacillus: Laclobacillus fermenlum sp. 273 el sp. 282,
Laclobacillus curvalus sp. 266, Laclobacillus casei sp. 235, Laclobacillus brevis Blet
LaClobacillus planlarum sp. 234, sp. 206 et sp. 285j ainsi que des souches du genre
pediococcus : Pediococcus acidilaclici sp. 286 et Pediococcus sp. se retrouvent dans une
même ligne phylogénétique (figure 48).
86

Lactobacillus panis
L-_ Lactobacillus oris
Lactobacillus pontis
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus jèrmentum
Cam273
Cam282
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus amylovorus
'-------- Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus acetolerans
Lactobacillus acidophi/us
Lactobacillus gasse ri
Lactobacillus am ylophi/us
,----- Cam266
Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sake
Cam286
Pediococcus acidilactici
Pediococcus pentosaceus
Cam267b
Cam272
Pediococcus damnosus
Pediococcus parvulus
Lactobacillus sanfrancisco
Lactobacillus lindneri
Lactobacillus homohiochii
Lactobacillus fructivorans
Lactobacillus kejr
Lactobacillus buchneri
Lactobacillus vermiforme
Lactobacillus hi/gardii
Lactobacillus brevis
CamBl
Lactobacillus plantarum
Cam234
Cam277
Cam206
Cam285j
Lactococcus plantarum
Figure 48 : Arbre phylogénétique des souches des genres Lactobacillus et Pediococcus sur la
base des séquences de la région de 1'hélice 6 du gène ARNr 16S.
87

On remarque donc, comme d'autres auteurs qui ont travaillé avec des séqunces
complètes (Staeckbrand et al. , 1988; Schleifer et al., 1989), que les genres lactobacillus et
Pediococcus ne sont pas génétiquement aussi distincts.
-Chez Leuconostoc et Weissella
L'ancien genre Leuconostoc a été recemment divisé en trois lignées génétiques
distinctes comme l'ont suggéré certains auteurs (Collins et al., 1993; Thunel, 1995). On aura
leuconostoc sensu stricto, le groupe leuconostoc paramesenteroides constitué des
lactobacillus atypiques (Lactobacillus confusus, Lactobacillus minor, Lactobacillus kandleri,
Lactobacillus halotolerante, et Lactobacillus viridescens) et Leuconostoc oenos qui à elle
seule forme un groupe distinct.
L'étude des séquences 16S et la détermination d'autres caractères a permis de reclasser
les lactobacillus atypiques dans le nouveau genre Weissella et Leuconostoc oenos dans un
autre genre dénommé Oenococcus (Schleifer et al., 1995).
La comparaison des séquences 16S chez les leuconostocs sensu stricto laisse paraître
que ce genre est relativement hétérogène.
Les leuconostocs sensu stricto isolés de nos échantillons peuvent être répartis dans trois
lignées distinctes.
La première lignée est constituée des souches proches de Leuconostoc mesenteroides et
de Leuconostoc pseudomesenteroides. Les souches de cette lignée ne différent que sur deux
bases au maximum dans la région de 1'hélice 6 et elles ne sont pas non plus identiques en ce
qui concerne les caractères biochimiques et les traits morphologiques. Des investigations plus
poussées à savoir une comparaison des séquences complètes 16S et 23S et 1'hybridation avec
les sondes génétiques spécifiques à LeuconoSIOC mesenteroides méritent d'être menées sur
cette 1ignée.
La seconde lignée est constituée par les espèces référence Leuconostoc amelibiosum,
Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc carnosum et les
souches 209a, 202 et 260.
La troisième lignée est constituée par Leuconostoc fructosus (ex Lactobacillus
fructosus) et les souches 227, 250 et 251. Ces souches, identiques au niveau de la région de
l'hélice 6 présentent des séquences complètes 16S avec un nombre important de nucléotides
différents (quinze nucléotides).
L'arbre phylogénétique dressé à partir des séquences de l'hélice 6 du gène ARNr 16S
des leuconostocs de nos échantillons et des souches de référence montre, tout comme la
comparaison directe de ces séquences, que Leuconostoc fallax aussi constitue un groupe à
part dans cette lignée et devrait faire l'objet d'une reclassification comme ce fut le cas avec
Leuconostoc oenos (figure 49).
./
./
88

.-------[--
0.10
Cam239
Cam 207
Cam201
Cam218
Cam209b
Cam201n
Cam226
Cam288b
Cam245
Cam278
Cam275
Cam216
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides subs cremoris
Leuconostoc pseudomesenteroides
Cam276
Cam288bl
Leuconostoc amelobiosum
Leuconostoc citreum
Leuconostoc lactis
Cam209a
Cam202
Camb260
Leucollostoc gelidum
Leuconostoc canlosum
Lactobacillus fructosus
Cam250
Cam251
Cam227
Cam250
Cam292
Leuconostoc jJllax
Oen ococcus oenl
Figure 49: Arbre phylogénétique des souches du genre Leuconostoc sur la base des
séquences de la région de l'hélice 6 du gène ARNr 16S.
89

Paenibacillus sp 691 fait partie d'une lignée phylogénétique comprenant Paenibacil/us
polymyxa, Paenibacillus azotoflXans, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis,
Paenibacil/us amylolyticus, Paenibacillus pabuli et Paenibacillus alvei qui sont toutes
reclassées dans ce genre
Gluconobacter 018
Toujours dans ce groupe des bactéries non lactiques, la souche 018 s'intègre
parfaitement dans le genre Gluconobacter (figure 52).
Acidiphilium rubrum
Thiobacillus acidophilus
Acidiphilium cryptum
Acidiphilium organoyorum
Acidiphilium jJCilis
Acidiphilium aminolytica
Gluconobacter
Gluconobacter cerin
Gluconobacter frateu
Gluconobacter oxydans
CamOl8
Acetobacter aceti
Acetobacter pasteurianus
Acetobacter europaeus
Acetobacter methanolicus
Acetobacter europaeus
Acetobacter xylinum
'----- Acetobacter hansenii
Acetobacter diazotro p1zicus
Acetobacter liquejJCiens
Figure 52: Arbre phylogénétique des souches du genre Gluconobacter sur la base des
séquences de la région de 1'hélice 6 du gène ARNr 16S.
3. CARACTERES BIOCHIMIQUES ET CLONAGE D'UN GENE D'AMYLASE
Les bio-industries utilisant les fonctions biologiques des micro-organismes sont
constamment confrontées à des problèmes liés à la qualité, à la reproductibilité de cette
qualité et à la productivité. La reproductibilité de la qualité désirée par le consommateur
dépend largement des organismes ou starter utilisés tout comme la productivité, qui elle est
tributaire des conditions de production, de l'accessibilité des substrats et surtout de la maîtrise
de l'outil biologique.
91

La détermination de quelques propriétés physiologiques intéressantes: activité
fermentaire, production d'exopolysaccharides et production de bactériocine a constitué la
base de caractérisation de nos souches.
3.1 Production de bactériocine
Dans les fermentations alimentaires, il est impératifd'utiliser des micro-organismes non
pathogènes et d'éviter toute contamination. L'acidification rapide et la production de
bactériocine permet souvent d'éviter le développement de certains organismes indésirables.
Dans le cas du vin de palme, l'activité antagoniste due aux bactériocines chez les
souches Lac/obacillus plan/arum sp. 206,277 et 285j et chez Leuconos/oc sp. 275 n'ont pas
empêché le développement dans certains échantillons de Bacillus cereus qui est un
toxinogène potentiel pouvant être responsable d'intoxications alimentaires.
3.2 Production d'exopolysaccharide
Une production importante d'exopolysaccharide est notée chez Lactobacillus
fermentum 273, mais il n'est pas souhaitable qu'un tel caractère s'exprime dans le vin de
palme. Ces exopolysaccharides peuvent être utiles pour la production d'aliments dans
lesquels une texture plus ou moins solide est recherchée comme les confitures et le yaourt.
3.3 Activité fermentaire
Les bactéries lactiques sont connues pour leur pouvoir fermentaire élevé, les souches
isolées de nos échantillons ne font pas exception à cette règle; un nombre important de sucres
est dégradé. Laclobacillus brevis BI, Laclobaci!lus planlarum sp. 277 et 285j présentent les
spectres fennentaires les plus larges.
Cette activité fermentaire est utilisée dans les bio-industries pour la production d'acides
organiques comme l'acide lactique, l'acide acétique et pour la production d'alcool comme
l'éthanol.
Le type d'activité fennentaire pennet aussi de caratériser ces micro-organismes. En ce
qui concerne le métabolisme du glucose, par exemple, les bactéries lactiques sont divisées en
homofennentaires et en hétérofennentaires. Les homofennentaire dégradent au moins 85%
du glucose en acide laètique et les 15% restant en biomasse et autres produits. Les
hétérofennentaires transfonnent entre 40 à 60% du glucose en acide lactique et le reste en
acide acétique, éthanol, formiate et en gaz carbonique.
Dans nos échantillons, nous notons aussi bien la présence de souches homofennentaires
que celle de souches hétérofermentaires. Il faut noter que le caractère homofermentaire ou
hétérofermentaire peut être modulé chez certaines souches suivant les proportions entre
sources de carbone et source d'azote disponibles. (M. C. Dieng, 1992).
Dans le vin de palme, la présence de levures des genres Saccharomyces et
Schizosaccharomyces connues pour leur fermentation alcoolique (production d'éthanol)
conjuguée à celle de Gluconobacter (Gluconobac/er sp. 018) utilisé surtout pour la
production du vinaigre laisse présager que la fennentation lactique (du fait des nombreuses
bactéries lactiques présentes) n'est pas le seul type de fermentation de cet écosystème.
92

3.4 Activité amylolytique et clonage du gène responsable
La grande majorité des souches isolées de nos échantillons n'attaquent pas l'amidon,
seules les souches Paenibacillus sp. 691 et Gluconobacter 018 présentent une activité
amylolytique.
L'activité amylolytique est intéressante chez la souche Paenibacillus sp. 691 par ce
qu'elle s'exprime dans des conditions de température idéales (30 à 40°C) et les exigences
nutritionnelles sembles relativement modérées. Ce résultat permet d'entrevoir d'une part la
possibilité d'utiliser cette souche pour la production de métabolites secondaires à partir de
déchets agricoles ou industriels amylacés comme la mélasse et d'autre part pour la production
d'enzyme (amylase).
La productivité de cette souche, si elle doit être utilisée comme starter, peut être
améliorée par les techniques du génie génétique permettant le transfert d'informations
génétiques à un organisme receveur. En effet, à partir du gène d'amylase Peanibacillus sp.
691 il à été possible de construire un recombinant E. coli HB101 amylase positive plus
productif que la souche Panibacillus sp. 691.
L'isolement des gènes d'amylase à l'aide d'amorces spécifiques à lactobacillus
al1ly!ovorus et la similitude entre les séquences permettent d'affirmer l'existence d'une
parenté génétique entre Paenibacillus sp. 691 et les bactéries lactiques en général.
Il existe donc, au regard des caractéristiques et des fonctions biologiques mises en
évidence, de nombreuses possibilités d'utilisation. A titre indicatif, le tableau 26 donne
quelques possibilités d'utilisation des souches étudiées ou créées (recombinant génétique
E.coli HB 101 amy +) lors de nos travaux.
Ta bleau
26 Quelques 1 pOSSI'bT' lites d'utlTIsatlOn Utilisation souche ayant les fonctions biologiques ciblées
Starter pour vin de palme (Lactobacillus plan/arum sp 206 +Leuconos/oc sp 275 +
Schizosaccharomyces .'>p 07+Saccharomyces cereviseae
sp 011 +)
Production de bactériocine pour la Lactobacillus plantarum sp 206
conservation d'aliments Leuconostoc sp 275
Production de gélifiant pour Lactobacillusfermentum sp 290
confitures
Production d'acide acétique et de Gluconobacter sp 018
vinaigre
Production d'alcool Leuconostoc sp 275
Saccharomyces cereviseae sp 011
Schizosaccharomvces /Jombe S/J 07
Production d'amylase Paenibaci//us sp 691
Recombinant génétique E.co/i HB 101 amy +
Il serait donc intéressant, dans une perspective d'exploitation de ces souches de faire les
études des cinétiques de croissance et de production pour préciser les rendements et optimiser
les procédés
/ /
93

CONCLUSION GENERALE

Nous avons pu au cours de cette étude identifier et caractériser la microflore
intervenant dans la fermentation de la sève de palmier par les techniques de la Biologie
Moléculaire.
L'identification des levures par les clefs dichotomiques basées sur les caractères
morphologiques et physiologiques ne donne pas toujours des résultats sans équivoque. La
combinaison des techniques d'identification à la PCR et au FTIR a permis une identification
rapide et plus sûre des espèces des genres Trichosporon, Saccharomyces et
Schizosaccharomyces isolées de nos différents échantillons.
Pour l'identification des bactéries, l'utilisation de sondes génétiques a permis de
déterminer un grand nombre de souches avec des économies de temps considérables. Cette
méthode nécessite tout de même des études morphologiques et biochimiques préalables
pouvant guider dans le choix des sondes. La réussite d'une telle analyse dépend pour
beaucoup de l'existence de sondes hautement spécifiques déduites à partir des séquences de
nucléotides des régions variables des gènes ARNr 16S et 23S.
C'est l'analyse des séquences de l'hélice 6 du gène ARNr 16S combinée au PCR
fingerprinting et à l'étude du spectre fermentaire et des traits morphologiques qui a permis
d'identifier la majorité de nos souches et souvent jusqu'à la sous espèce. Les arbres
phylogénétiques faits à partir des séquences de l'hélice 6 sont en accord avec les
classifications les plus actuelles.
Ainsi les résultats obtenus confirment l'appartenance à la même lignée génétique des
genres Pediococcus et Lactobacillus. L'hétérogénéité du genre Leuconostoc et la nécessité de
reclasser certaines souches appartenant à ce genre dans d'autres genres qui sont Oenococcus
et Weissella.
Les voies métaboliques connues chez les bactéries et les levures isolées de nos
échantillons laissent prévoir pour le vin de palme une fermentation à la fois lactique,
alcoolique et acétique. Nous avons également noté la présence de micro-organismes
indésirables comme Baeil/us eereus dont certaines souches sont toxinogènes et souvent à
l'origine d'intoxication alimentaire dans les procédés traditionnels. Ces constats renforcent la
nécessité d'opter pour un contrôle des procédés avec l'utilisation de starter sélectionnés.
Lorsque des organismes doivent être sélectionnés pour une utilisation
biotechnologique, il devient impérieux d'identifier ces organismes et de connaître leurs
propriétés métaboliques. Ainsi dans cette étude les techniques utilisées ont permis d'identifier
et de caractériser des souches de bactéries appartenant aux genres Lactobacillus, Pediococcus,
Gluconobacter, Weissella, Bacillus et Paenibacillus et des levures appartenant surtout aux
genres Saccharomyces, Schizosaccharomyces et Trichosporon.
Certaines souches présentent des caractéristiques intéressantes telles la production de
bactériocine chez la quasi-totalité des souches identifiées comme Laetobaeillus p/antarum et
chez Leueonostoes sp. 275 , la production d'amylase chez Paenibaeillus sp. 691 et sécrétion
d'exopolysaccharides chez Laetobaeil/usfermentum sp. 270.
./ ./
94

D'autres caractéristiques comme la possibilité de fabriquer des recombinants ont pu être
mises en évidence. Cest ainsi qu'un recombinant génétique Amylase positive a pu être
obtenu en clonant le gène responsable de l'activité amylolytique de la souche Paenibacillus
sp. 691 du vin de palme chez E. coli HB 101.
Toutes ces caractéristiques que nous avons étudiées confèrent aux souches isolées du
vin de palme des potentialités biotechnologiques intéressantes à plus d'un titre et font d'elles
des outils pour la production de métabolites, d'enzymes etc. Ce qui renforce la nécessité de
poursuivre cette étude par des études des cinétiques de croissance et de production pour
préciser les possibilités d'exploitation de ces souches
./
95

./
ANNEXE

SEQUENCES UTILISEES
l-Lactobacillus et Pediococcus
Lactobacillus plantarum
Lactobacillusfarcimini
Lactococcus plantarum
Lactobacillusfermentum
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei subs. rhamnosus
Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sake
Lactobacillus brevis
Pediococcus acidilactici
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus pardalus
Pediococcus damnosus
Souches des genres lactobacillus et pcdiococcus isolées du vin de palme
Cam 234 : Lactobacillus plantarum sp. 234
Cam 277 : LactobaciLLus plantarum sp. 277
Cam 285j : Lactobacillus plantarum sp. 285j
Cam 206 : Lactobacillus plantarum sp. 206
Cam 273 : LactobacUlusfermentunz sp.273
Cafi 282 : Lactobacillusferme/ltum sp. 282
Cam 235 : : Lactobacillus casei sp.235
Cam 266 : : Lactobacillus curvatus sp. 266
Cam BI : Lactobacillus brevis sp. BI
Cam 286: Pediococcus sp.286
Cam 267b : Pediococcus sp.267b
Cam 272 : Pediococcus sp.272
./
96
./

2-Leuconostoc
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc pseudomesenteroides
Leuconostoc lactis
Leuconostoc amelibiosum
Leuconostoc citreum
Leuconostoc gelideum
Leuconostoc carnosum
Leuconostocfructosus (Lactobacillus fructosus)
Leuconostocfallax
Oeno.oenos : Oenococcus oenos (Leuconostoc oenos)
Soucbes du genre leuconostoc isolées du vin de palme
Cam 216: Leuconostoc sp. 216
Cam 292: Leuconostoc sp. 292
Cam 201 : Leuconostoc sp. 201
Cam 218 : Leuconostoc sp. 218
Cam 209b : Leuconostoc sp. 209b
Cam 226 : Leuconostoc sp. 226
Cam 245 : Leuconostoc sp. 245
Cam 278 : Leuconostoc sp. 278
Cam 275 : Leuconostoc sp. 275
Cam 276: Leuconostoc sp. 276
Cam 288bl : Leuconostoc sp. 288bl
Ca m 286 : Leuconostoc sp. 286
Cam 267b : Leuconostoc sp. 267b
Cam 272 : Leuconostoc sp. 272
Cam 238 : Leuconostoc sp. 238
Cam 207 : Leuconostoc sp. 207
Cam 209a : Leuconostoc sp. 209a
Cam 202: LeucOlwstoc sp. 202
Cam 260: Leuconostoc sp. 260
Cam 250: Leuconostoc sp. 250
Cam 251 : Leuconostoc sp. 251
Cam 227 : Leuconostoc sp. 227
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98

3-Weissella
Weissella hellenica
Weissella confusus2
Weissella minor (Lactobacillus minor)
Weissella halotolerant
Weissella paramesenteroides
Weissella kandleri
Weissella confusu3
Weissella paramesenteroides3
Weissella viridiscens
Souches du genre weissella isolées du vin de palme
Cam 255 : Weissella sp. 255
Cam243 b : Weissell sp. 243 b
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101

Les « non lactiques»
Paenibacillus macerans
Baeil/us eereus
Thermobaeillus amylolytieus
Sporolaetobaeillus dextranieus
Gluconobactersuboxydans
Heliothrix virescens
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus sciurus
Souches « non lactiques» isolées du vin de palme
Cam.69l : Paenibacillus sp. 691
Cam.E20l : Baeil/us eereus sp. E20l
Cam.018 : Gluconobacter suboxydans sp.018
Cam.244 : souche 244
Cam.29l : Staphylococcus sp.291
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