CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

) Pour la détection des gènes eae (amorces à 600nM et sonde à 200nM), O111 (amorces à
1000nM et sonde à 200nM) et des gènes codant pour les antigènes somatiques O26, O103,
O145 et O157 (amorces à 500nM et sonde à 200nM) :
eae - Volumes
en µL
O157, O26, O103
et O145 -
Volumes en µL
O111 - Volumes
en µL
Nombre de tubes: 1 1 1
Master Mix (2X) 15 15 15
H 2O 4,2 4,8 1,8
IPC Mix (10X) 3 3 3
Amorces x2 (10µM) 1,8 1,5 3
Sonde (10µM) 0,6 0,6 0,6
IPC DNA (50X) 0,6 0,6 0,6
ADN (par puits) 3 3 3
L’amplification est évaluée par l’augmentation de la fluorescence du reporter (sonde) et ceci à
chaque cycle d’amplification. Au préalable, le programme d’analyse du StepOne d'Applied
Biosystems calcul le bruit de fond du mix+ADN. Son cycle d’amplification figure dans la
figure 28. Cette RT-PCR cible le gène codant pour la synthèse de l’antigène somatique
recherché. Les amorces utilisées sont celle recommandées par l’AFSSA (Perrelle et al.. 2004)
et par Nielsen and Andersen (2003) (Tableau 13). Les résultats sont analysés en fonction du
CT (Cycle Threshold). Le CT correspond au nombre de cycles d’amplification réalisés au
moment où la courbe d’amplification dépasse la limite de positivité (Threshold).
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