CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne
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) Pour la détection <strong>de</strong>s gènes eae (amorces à 600nM et son<strong>de</strong> à 200nM), O111 (amorces à<br />
1000nM et son<strong>de</strong> à 200nM) et <strong>de</strong>s gènes codant pour les antigènes somatiques O26, O103,<br />
O145 et O157 (amorces à 500nM et son<strong>de</strong> à 200nM) :<br />
eae - Volumes<br />
en µL<br />
O157, O26, O103<br />
et O145 -<br />
Volumes en µL<br />
O111 - Volumes<br />
en µL<br />
Nombre <strong>de</strong> tubes: 1 1 1<br />
Master Mix (2X) 15 15 15<br />
H 2O 4,2 4,8 1,8<br />
IPC Mix (10X) 3 3 3<br />
Amorces x2 (10µM) 1,8 1,5 3<br />
Son<strong>de</strong> (10µM) 0,6 0,6 0,6<br />
IPC DNA (50X) 0,6 0,6 0,6<br />
ADN (par puits) 3 3 3<br />
L’amplification est évaluée par l’augmentation <strong>de</strong> la fluorescence du reporter (son<strong>de</strong>) et ceci à<br />
chaque cycle d’amplification. Au préalable, le programme d’analyse du StepOne d'Applied<br />
Biosystems calcul le bruit <strong>de</strong> fond du mix+ADN. Son cycle d’amplification figure dans la<br />
figure 28. Cette RT-PCR cible le gène codant pour la synthèse <strong>de</strong> l’antigène somatique<br />
recherché. Les amorces utilisées sont celle recommandées par l’AFSSA (Perrelle et al.. 2004)<br />
et par Nielsen and An<strong>de</strong>rsen (2003) (Tableau 13). Les résultats sont analysés en fonction du<br />
CT (Cycle Threshold). Le CT correspond au nombre <strong>de</strong> cycles d’amplification réalisés au<br />
moment où la courbe d’amplification dépasse la limite <strong>de</strong> positivité (Threshold).<br />
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