CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

Enfin, pour permettre à la solution PREPMAN d’agir, le microtube vissé a été chauffé 10 min
à 100 °C. Après refroidissement (environ 2min à température ambiante) le microtube a de
nouveau été centrifugé 2 min à 13 000 rpm (centrifugeuse 5415 D, eppendorf). Le surnageant
a pu alors être analysé par RT-PCR.
La RT-PCR (Real Time Polymérase Chaine Reaction) utilisée pour les différentes études a été
mise au point au sein du laboratoire, elle est détaillée ci-dessous :
Le kit de RT-PCR utilisé est le Master Mix d'Applied Biosystems (TaqMan gene expression
Master Mix). La RT-PCR a été réalisée sur l’automate StepOne d'Applied Biosystems. Le
volume d'échantillon ajouté au mix de RT-PCR était de 3µl pour un volume final de 30µl de
Mix. Les concentrations et volumes des différents composants du mix sont répertoriés dans
les tableaux 12 a) et b).
Tableau 12 : Composition du mix de RT-PCR :
a) Pour la détection des gènes stx 1 et stx 2 (amorces à 1000nM et sondes à 200nM) :
Pour le stx 1 et 2
- Volumes en µL
nombre de tubes 1
Master Mix (2X) 15
MgCl2 (25mM) 3,6
H2O 0,6
IPC Mix (10X) 3
Amorces stx1-1 1 à 20pmol/µL 1,5
Amorces stx1-2 2 à 20pmol/µL 1,5
Sonde Stx1 (10µM) 0,6
Sonde Stx2 (10µM) 0,6
IPC DNA (50X) 0,6
ADN (par puits) 3
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