CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

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Figure 14 : Automate chromo4 à gauche et automate Miniopticon à droite Ces automates permettent la réalisation d’une PCR. Lors de l’amplification une sonde de type Beacon (sonde brevetée) s’hybride sur la séquence cible permettant l’émission de fluorescence. La lecture de fluorescence se fait au moment de l’hybridation. Le logiciel associé à l’appareil calcule automatiquement la relation entre l’intensité de fluorescence et le cycle d’amplification. Cette relation indique la présence ou l’absence présomptive de E. coli O157:H7 dans la prise d’essai analysée. Un ADN synthétique « contrôle interne » est amplifié en même temps que la séquence cible. La durée de la PCR est comprise entre 2h20 et 2h30 et un kit IQ-Check contient la quantité de réactifs nécessaire pour 96 analyses (réactifs et billes de lyse, sondes fluorescentes, solution d’amplification, contrôle négatif et positif). Il est important de noter que l’ensemble de ces kits de détection n’est validé que pour un domaine d’application particulier (fromage, viande crue de bœuf…), et que le protocole d’enrichissement varie en fonction des kits (durée d’enrichissement, prise d’essai, bouillon d’enrichissement…). Le test HQS_E.Coli O157:H7 (ADNucleis): Le test HQS E. coli O157:H7 repose sur la technique PCR associée à la détection utilisant le SYBERgreen (Figure 15). Cette méthode permet la détection des E. coli O157:H7 après un enrichissement de 12 à 24 heures à 37°C en bouillon PCRone®. Le kit est constitué d’un mélange réactionnel d’extraction d’ADN génomique, d’un kit de purification des ADN et de tubes de réaction PCR destinés à l’obtention d’amplicons 72
spécifiques d’E. coli O157:H7. L’interprétation des résultats se fait à partir des graphiques et des données de la qPCR. Ce test présente la particularité d’être validé AFNOR pour une utilisation sur les thermocycleurs suivants : -Appied Biosystems : ABI 70000 / 7300 / 7500 / 7900 -Qiagen : Rotorgene -Eppendorf : Realplex -Stratagene : MX3005P Figure 15 : Kit HQS E. coli O157:H7 commercialisé par la société ADNucleis 4.2. La détection des autres STEC Les différentes méthodes décrites pour la détection des STEC non-O157 reposent essentiellement sur la détection de la production des Shiga-toxines, en général après une étape d'enrichissement. Plusieurs tests ELISA ont été décrits. Certains d'entre eux utilisent des anticorps monoclonaux dirigés contre la toxine Stx, tandis que d'autres sont basés sur la propriété des Shiga-toxines à se lier aux glycolipides présentant une terminaison α-D-Gal-(1- 4)-D-Gal, des récepteurs Gb3 purifiés, du lyso- Gb3 ou du liquide de kyste hydatique. Dans les différents protocoles, la détection est réalisée à l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la toxine stx, et la révélation avec des anticorps liés à la phosphatase alcaline. Cependant, ces méthodes ne se sont pas révélées aussi sensibles que le test sur cellules Vero. En outre, sachant que les variants stx n’ont pas tous la même 73
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UNIVERSITE DE BOURGOGNE THÈSE Pour
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Levine, M. (1987) Escherichia coli
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