CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne
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Un grand nombre <strong>de</strong> tests <strong>de</strong> PCR en temps réel utilisant <strong>de</strong>s son<strong>de</strong>s spécifiques <strong>de</strong> stx1 et<br />
stx2 existent, mais la plupart ne sont pas adaptés comme outils <strong>de</strong> diagnostic car ils ne<br />
comportent pas <strong>de</strong> contrôles internes et pourraient conduire à l’obtention <strong>de</strong> faux négatifs.<br />
L'utilisation d’un contrôle interne en PCR en temps réel pour la détection spécifique <strong>de</strong>s<br />
STEC a été expérimentée par Bélanger et al. (2002) ou Stefan et al. (2007). Dans les <strong>de</strong>ux<br />
cas, l'amplification du plasmi<strong>de</strong> contrôle interne était réalisée à l’ai<strong>de</strong> d’une paire d’amorces<br />
distincte <strong>de</strong> celle utilisée pour amplifier la cible. L’inconvénient <strong>de</strong> ce principe est que cela ne<br />
reflète pas avec exactitu<strong>de</strong> l'amplification <strong>de</strong> la cible du test, à cause <strong>de</strong>s efficacités variables<br />
obtenues en utilisant <strong>de</strong>s couples d’amorces différents. Auvray et al.(2009) ont développé une<br />
PCR en temps réel <strong>de</strong> type compétitif où une paire d'amorces unique sert à amplifier le<br />
contrôle interne et tous les variants <strong>de</strong> stx1 et stx2, à l'exception <strong>de</strong> stx2f. Pour permettre la<br />
distinction <strong>de</strong>s cibles amplifiées, trois son<strong>de</strong>s spécifiques <strong>de</strong> stx1, stx2 et du contrôle interne<br />
ont été conçues. Après enrichissement, ce test a été en mesure <strong>de</strong> détecter <strong>de</strong>s STEC dans <strong>de</strong><br />
la vian<strong>de</strong> hachée contaminée à un taux <strong>de</strong> 10 UFC <strong>de</strong> STEC / 25g.<br />
La détection en temps réel représente l’avantage d’être plus rapi<strong>de</strong> et d’éviter l’étape <strong>de</strong><br />
détection via la réalisation d’un gel d’agarose ainsi que l’utilisation <strong>de</strong> BET qui est un agent<br />
mutagène. De plus, la RT-PCR permet <strong>de</strong> limiter les contaminations croisées qui étaient<br />
possibles lors du dépôt <strong>de</strong>s amplicons sur les gels d’agarose en PCR en point final ou<br />
traditionnelle. Pour finir, grâce à la RT-PCR, il est possible <strong>de</strong> faire <strong>de</strong> la PCR quantitative, ce<br />
qui est impossible avec une étape <strong>de</strong> dépôt sur gel mais également <strong>de</strong>s PCR <strong>de</strong> type<br />
« multiplexe ». Le terme <strong>de</strong> "PCR multiplexe" désigne une mise au point <strong>de</strong> la technique PCR<br />
autorisant l'amplification, en une seule réaction, <strong>de</strong> plusieurs segments d'ADN distincts. Le<br />
premier avantage <strong>de</strong> cette adaptation technique est la réduction du coût et la diminution du<br />
temps <strong>de</strong> réalisation et, éventuellement, d'analyse <strong>de</strong>s résultats. Elle est donc <strong>de</strong> nature à<br />
réduire aussi la quantité d'ADN nécessaire à ces analyses.<br />
Les automates capable <strong>de</strong> réaliser une RT-PCR<br />
Il existe <strong>de</strong>ux types d’automates sur le marché, les premiers, ceux dit « fermés ». Ces<br />
automates sont commercialisés avec un logiciel qui interprète les données afin <strong>de</strong> rendre un<br />
résultat positif ou négatif. Des kits prêts à l’emploi et spécifiques d’une bactérie ou d’une<br />
espèce bactérienne sont vendus pour ces automates. Les sociétés Genesystems ou encore<br />
Oxoid commercialisent <strong>de</strong> tels automates (voir parties suivantes : automate BAX et automate<br />
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