CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

Un grand nombre de tests de PCR en temps réel utilisant des sondes spécifiques de stx1 et
stx2 existent, mais la plupart ne sont pas adaptés comme outils de diagnostic car ils ne
comportent pas de contrôles internes et pourraient conduire à l’obtention de faux négatifs.
L'utilisation d’un contrôle interne en PCR en temps réel pour la détection spécifique des
STEC a été expérimentée par Bélanger et al. (2002) ou Stefan et al. (2007). Dans les deux
cas, l'amplification du plasmide contrôle interne était réalisée à l’aide d’une paire d’amorces
distincte de celle utilisée pour amplifier la cible. L’inconvénient de ce principe est que cela ne
reflète pas avec exactitude l'amplification de la cible du test, à cause des efficacités variables
obtenues en utilisant des couples d’amorces différents. Auvray et al.(2009) ont développé une
PCR en temps réel de type compétitif où une paire d'amorces unique sert à amplifier le
contrôle interne et tous les variants de stx1 et stx2, à l'exception de stx2f. Pour permettre la
distinction des cibles amplifiées, trois sondes spécifiques de stx1, stx2 et du contrôle interne
ont été conçues. Après enrichissement, ce test a été en mesure de détecter des STEC dans de
la viande hachée contaminée à un taux de 10 UFC de STEC / 25g.
La détection en temps réel représente l’avantage d’être plus rapide et d’éviter l’étape de
détection via la réalisation d’un gel d’agarose ainsi que l’utilisation de BET qui est un agent
mutagène. De plus, la RT-PCR permet de limiter les contaminations croisées qui étaient
possibles lors du dépôt des amplicons sur les gels d’agarose en PCR en point final ou
traditionnelle. Pour finir, grâce à la RT-PCR, il est possible de faire de la PCR quantitative, ce
qui est impossible avec une étape de dépôt sur gel mais également des PCR de type
« multiplexe ». Le terme de "PCR multiplexe" désigne une mise au point de la technique PCR
autorisant l'amplification, en une seule réaction, de plusieurs segments d'ADN distincts. Le
premier avantage de cette adaptation technique est la réduction du coût et la diminution du
temps de réalisation et, éventuellement, d'analyse des résultats. Elle est donc de nature à
réduire aussi la quantité d'ADN nécessaire à ces analyses.
Les automates capable de réaliser une RT-PCR
Il existe deux types d’automates sur le marché, les premiers, ceux dit « fermés ». Ces
automates sont commercialisés avec un logiciel qui interprète les données afin de rendre un
résultat positif ou négatif. Des kits prêts à l’emploi et spécifiques d’une bactérie ou d’une
espèce bactérienne sont vendus pour ces automates. Les sociétés Genesystems ou encore
Oxoid commercialisent de tels automates (voir parties suivantes : automate BAX et automate
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