CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

Contrairement aux agents intercalants, les sondes Taqman offrent la possibilité de faire de la
PCR multiplexe (détection de plusieurs cibles en même temps). La PCR multiplexe permet
d’ajouter un contrôle interne afin de vérifier si l’amplification a bien eu lieu (absence
d’inhibiteur), ou encore de détecter plusieurs pathogènes. Les sondes Taqman pouvant être
couplées à plusieurs types de fluorochromes (FAM, TAMRA…) absorbant ou émettant à des
longueurs d’ondes différentes, cette technologie présente l’avantage de pouvoir rechercher
plusieurs cibles en parallèle contrairement aux agents intercalants.
Les limites et avantages des méthodes PCR
Les méthodes PCR pour la détection des STEC dans des matrices complexes telles que les
aliments montrent cependant certains inconvénients comme l’incapacité à distinguer l’ADN
des bactéries cibles de l’ADN libre, de cellules mortes ou provenant de phages. Les
marqueurs détectés dans les aliments ne sont pas nécessairement présents sur la même souche
et peuvent être situés sur différentes souches non pathogènes. Ainsi, une étape d’isolement est
nécessaire pour récupérer la souche à l’origine des signaux PCR.
L’optimisation de la sensibilité des méthodes de PCR est un point essentiel sachant que la
quantité de STEC dans les aliments est le plus souvent très faible. Un des écueils majeurs
pour la mise au point de ces méthodes est la présence d’inhibiteurs de la Taq polymérase dans
les matrices complexes. Dans une étude réalisée par Brian et al. (1992), la sensibilité de la
PCR était 100 fois plus faible lorsque l'ADN provenait de fèces artificiellement contaminées
en STEC que lorsqu’il était extrait à partir de cultures pures. Pour limiter la présence
d’inhibiteurs, plusieurs méthodes peuvent être mises en oeuvre. Tout d’abord, la phase
d’enrichissement présente l’avantage, outre le fait de permettre la croissance des bactéries
recherchées et par conséquent d’augmenter le nombre de cibles pour la PCR, de diluer les
inhibiteurs présents dans l'échantillon. Cependant, certains protocoles sont destinés à détecter
les STEC directement à partir des aliments sans enrichissement. Plusieurs auteurs ont
recommandé de séparer les bactéries ou leur ADN de la matrice avant d'effectuer la PCR
(Bouvet et Vernozy-Rozand, 2000). L’ajout d'albumine sérique bovine ou d’inhibiteurs de
protéases ont également été testés (Chen et al., 1998). Après avoir constaté que la teneur en
matières grasses de la viande hachée était un élément majeur d'inhibition, Begum et Jackson
(1995) ont réussi à réduire la quantité d'inhibiteurs en diluant les échantillons d’un facteur
1000. Grâce à cette technique, ils ont pu détecter 30 STEC par ml -1 de boeuf haché
homogénéisé.
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