CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

Notons toutefois qu’une préparation des échantillons qui utilise uniquement une méthode de
lyse peut-être insuffisante voir inefficace. En conséquence, une préparation des acides
nucléiques complète peut être choisie. Il s’agit de méthodes lourdes employant le plus souvent
du phénol, du chloroforme et de l’éthanol (Gore et al., 2003). De fait, des méthodes
d’extraction de l’ADN
grâce à des kits d’extraction ont vu le jour. Leur principe est le suivant : la première étape
consiste à lyser les bactéries (physique et/ou chimique), en parallèle, une inactivation des
RNases a lieu, ensuite l’ADN est absorbé sur une membrane de silice contenue dans une
colonne spéciale. Une étape de lavage de cet ADN, puis une élution est réalisée. Ces kits
présentent l’avantage d’obtenir un ADN purifié et concentré, mais leur mise en œuvre
nécessite beaucoup de temps. Pour réduire ce temps, il est possible d’extraire et de purifier ces
acides nucléiques avec des automates d’extraction. Il existe par exemple: l’automate EZ1
commercialisé par la société Qiagen ou encore l’automate EASYMAG commercialisé par la
société BioMérieux (Figure 10).
Toutes les étapes réalisées manuellement ou de manière automatique permettent de concentrer
et de purifier les acides nucléiques et donc d’obtenir un meilleur seuil de détection. En effet,
elles permettent d’éliminer une partie des inhibiteurs matriciels. Actuellement, très peu
d’informations sont disponibles sur les inhibiteurs des réactions de biologie moléculaire et la
manière de les maîtriser. Ils peuvent être issus de l’échantillon lui-même (protéines, gras,
caséine….) ou de la méthode de préparation des échantillons avant analyse (composant du
bouillon d’enrichissement, produit employé lors de la préparation de l’ADN…..).
De manière générale, les faux résultats négatifs qui résultent de l’action des inhibiteurs,
peuvent apparaître pour diverses raisons :
-L’inactivation des enzymes du mélange réactionnel
-La dégradation ou capture des acides nucléiques (séquences cibles ou amorces)
-La lyse cellulaire insuffisante
L’utilisation des kits d’extraction permet de s’affranchir de bon nombre d’inhibiteurs de PCR.
Lorsque ces kits ne sont pas employés, une dilution de l’échantillon à analyser par PCR
permet de diluer les inhibiteurs présents, autorisant le plus souvent l’amplification de l’ADN
cible. Cette pratique présente cependant l’inconvénient de diluer également l’ADN recherché
et de diminuer ainsi la sensibilité de la PCR.
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