CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

More documents

Recommendations

Info

CHAPITRE 4 : Mise au point d’un test permettant de concentrer les 5 sérogroupes de E. coli majeurs selon l’AFSSA (VIDAS ESPT) 1. Introduction Nous avons souligné que E. coli O157 :H7 est identifié comme le chef de file des STEC puisqu’il est à l’origine de nombreuses épidémies. L’EFSA recommande donc aux industriels de l’agro alimentaire d’axer principalement leurs analyses sur ce sérotype. Néanmoins, d’autres épidémies ont été liées à la consommation d’aliments contaminés par des souches de E. coli appartenant à d’autres sérotypes. Ainsi, l’AFSSA a défini 5 sérotypes considérés comme pathogènes, et l’EFSA indique que la recherche des STEC pathogènes pourrait être étendue aux sérogroupes O26, O103, O91, O145 et O111. Un projet de norme du groupe de travail CEN TC275/WG6 a ainsi vu le jour. Il est actuellement soumis à l’ISO pour évaluation. Il s’agit d’une méthode horizontale basée dans un premier temps sur une PCR en temps réel destinée à rechercher les facteurs de virulence eae et stx puis les gènes codant les antigènes somatiques des 5 sérogroupes O157, O26, O103, O145 et O111 dans les bouillons d’enrichissement des matrices alimentaires. Cette étape est suivie, si les PCR se révèlent positives par une étape de confirmation visant à isoler les souches suspectées d’être présentes. Cette étape emploie une technique difficile à mettre en œuvre par les industriels ou laboratoires de routine : l’IMS. Cette technique qui est lourde, fastidieuse et peut générer des contaminations croisées ne permet un isolement des STEC que sérogroupe par sérogroupe. La technique présentée ci-dessous est une méthode automatisée utilisant le VIDAS, et qui permettrait de détecter et d’isoler par concentration des 5 sérogroupes en même temps. Une étude préalable a été nécessaire afin d’évaluer individuellement les nouvelles protéines de phage que BioMérieux souhaitait utiliser pour la mise au point de son nouveau kit VIDAS. 126
2. Etude préalable à l’élaboration des cônes 5 sérogroupes 2.1. La technologie : des protéines de phage Les fabrications de protéines de phage n’ont pas été réalisées au cours des travaux de cette thèse. Certaines étapes sont d’ailleurs restées confidentielles. Cependant, il nous est apparu intéressant de présenter de manière succinte cette technologie. Les bactériophages sont des virus très spécifiques qui infectent exclusivement les bactéries. Ils ont recours à des structures d’adhérence pour se fixer à leurs bactéries hôtes. Dans le cas du VIDAS ESPT, des protéines de liaison spéciales provenant des bactériophages sont utilisées pour la capture et la détection ciblées de bactéries présentes dans un échantillon (Figure 30). Cette technologie offre une sensibilité et une spécificité de très haut niveau par rapport aux anticorps qui étaient utilisés auparavant. Les bactériophages font partie des formes de vie les plus abondantes du globe et sont programmés exclusivement pour infecter et identifier les bactéries hôtes. Les phages évoluent avec les bactéries depuis plus d’un milliard d’années et sont capables de survivre dans les environnements les plus extrêmes comme le sol, les déchets d’origine animale ou les intestins. Les travaux de recherche montrent que les phages offrent un certain nombre d’avantages par rapport aux anticorps, comme une spécificité et un pouvoir de fixation supérieurs, lors de leur utilisation dans les systèmes de tests microbiologiques. Il semblerait que les protéines de phages fournissent des performances robustes dans de nombreuses applications, mêmes lorsqu’elles sont exposées aux matrices alimentaires les plus difficiles et les plus complexes. Il faut savoir que les protéines de phage nous ont été fournies par une société allemande qui travaille en partenariat avec bioMérieux et qui élabore les protéines de phage de la façon suivante : Dépistage et identification des phages spécifiques de l’agent pathogène d’intérêt Séquençage de la protéine Clonage Production et purification de la protéine recombinante Etiquetage de la protéine recombinante. 127
Page 1 and 2:
UNIVERSITE DE BOURGOGNE THÈSE Pour
Page 3 and 4:
Je remercie… Monsieur Vincent Atr
Page 5 and 6:
Résumé Les Escherichia coli produ
Page 7 and 8:
Liste des tableaux ................
Page 9 and 10:
CHAPITRE 2: Optimisation de la phas
Page 11 and 12:
Liste des tableaux Tableau 1 : Prin
Page 13 and 14:
Figure 23 : Protocole de recherche
Page 15 and 16:
INTRODUCTION 15
Page 17 and 18:
dans les aliments (NF EN ISO 16654)
Page 19 and 20:
Mémoire bibliographique 19
Page 21 and 22:
(+), positif pour la majorité des
Page 23 and 24:
Les E. coli Entéroaggrégatifs (EA
Page 25 and 26:
• elle doit appartenir aux sérot
Page 27 and 28:
Figure 3 : Modèle hypothétique de
Page 29 and 30:
et in vivo ont été réalisées af
Page 31 and 32:
2.4. Autres facteurs de virulence L
Page 33 and 34:
diverses origines (toxique, auto-im
Page 35 and 36:
Plusieurs études ont également ra
Page 37 and 38:
• Populations sensibles Les perso
Page 39 and 40:
Tableau 3 : Fréquences observées
Page 41 and 42:
cultures épithéliales mammaires p
Page 43 and 44:
Figure 5 : Flux potentiels de STEC.
Page 45 and 46:
(Pavia et al., 1990). Ce mode de tr
Page 47 and 48:
Pendant les années 80, la plupart
Page 49 and 50:
non-O157 n’est validée à ce jou
Page 51 and 52:
actéries. En l’absence de flore
Page 53 and 54:
Dans notre étude, nous nous sommes
Page 55 and 56:
augmente à hauteur de 95% avec une
Page 57 and 58:
Néanmoins, quelques études ont mi
Page 59 and 60:
la bactérie recherchée. Enfin, il
Page 61 and 62:
Systèmes immuno-chromatographiques
Page 63 and 64:
sur les E. coli cibles, eux mêmes
Page 65 and 66:
Notons toutefois qu’une préparat
Page 67 and 68:
Révélation lors de la RT-PCR : Il
Page 69 and 70:
Un grand nombre de tests de PCR en
Page 71 and 72:
L’automate Genesystems: L’autom
Page 73 and 74:
spécifiques d’E. coli O157:H7. L
Page 75 and 76: Ltd, Norvège). Toutefois, les souc
Page 77 and 78: Figure 17 : Projet de normalisation
Page 79 and 80: (Figure 19). Ces milieux sont des m
Page 81 and 82: Isolement des STEC non-O157:H7 En c
Page 83 and 84: Figure 23 : Protocole de recherche
Page 85 and 86: Tableau 9 : Méthodes validées AFN
Page 87 and 88: Comme il a été décrit précédem
Page 89 and 90: 1. Les souches Des souches de diver
Page 91 and 92: Tableau 10 : Souches utilisées lor
Page 93 and 94: été réalisés (1 à 10 UFC/ml) (
Page 95 and 96: de l’automate. C’est elle qui p
Page 97 and 98: ) Pour la détection des gènes eae
Page 99 and 100: Tableau 13 : Les séquences des amo
Page 101 and 102: Résultats 101
Page 103 and 104: habitant, dont 16,9 kilos de fromag
Page 105 and 106: 105
Page 107 and 108: 107
Page 109 and 110: 109
Page 111 and 112: 111
Page 113 and 114: O26 a été évaluée. Par conséqu
Page 115 and 116: délai d’analyse oblige les indus
Page 117 and 118: 117
Page 119 and 120: 119
Page 121 and 122: 121
Page 123 and 124: 123
Page 125: Cette étude a finalement montré q
Page 129 and 130: concentrations : des souches spéci
Page 131 and 132: expérimentalement ensemencées ava
Page 133 and 134: virulence status means that absence
Page 135 and 136: Strains reference origin E. coli O2
Page 137 and 138: For analysis, 800µL of enrichment
Page 139 and 140: E. coli strains O26 O103 O111 O145
Page 141 and 142: IMS sensitivity may also be affecte
Page 143 and 144: Morgan, D., Newman, C.P., Hutchinso
Page 145 and 146: Cette nouvelle méthode de concentr
Page 147 and 148: Discussion et perspectives 147
Page 149 and 150: être utilisés en fonction de la m
Page 151 and 152: sérotype dans d’autres aliments.
Page 153 and 154: A ce jour, il n’y a aucune métho
Page 155 and 156: de confirmation qui détermineront
Page 157 and 158: également optimisé les performanc
Page 159 and 160: Annexes 159
Page 161 and 162: DuPont Lateral Flow System E. coli
Page 163 and 164: Annexe 3: Souches utilisées au cou
Page 165 and 166: Annexe 5: Novel phage ligand based
Page 167 and 168: Annexe 7: Novel phage ligand based
Page 169 and 170: Annexe 9: Novel Phage Immuno concen
Page 171 and 172: Références bibliographiques 171
Page 173 and 174: Barwick, R.S., Levy, D.A., Craun, G
Page 175 and 176: Bosilevac, J.M., Guerini, M.N., Bri
Page 177 and 178:
Chapman, P.A., Siddons, C.A., Cerda
Page 179 and 180:
Donnenberg, M. S., Tzipori S., McKe
Page 181 and 182:
Grau, F. H., and Vanderline P.B. (1
Page 183 and 184:
Jarvis, K. G., and Kaper J. B.. (19
Page 185 and 186:
Levine, M. (1987) Escherichia coli
Page 187 and 188:
Meyer-Broseta, S., Bastian, S.N., A
Page 189 and 190:
Ogden, I.D., Hepburn, N.F., MacRae,
Page 191 and 192:
Reid, S. D., Herbelin C. J., Bumbau
Page 193 and 194:
Shukla, R., Slack, R., George, A.,
Page 195 and 196:
Trabulsi. (1998) Characterization o
Page 197:
Wieler, L. H., McDaniel T. K., Whit
show all

CHAPITRE 1 - Université de Bourgogne

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?