Extraction, caractérisation chimique et valorisation biologique de ...
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Préparation <strong>de</strong>s inserts pour l’invasion<br />
Pour l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’invasion cellulaire, l’intérieur <strong>de</strong>s inserts (déposés dans les puits <strong>de</strong> la<br />
plaque companion) est recouvert par 100 µL <strong>de</strong> Matrigel à 10 mg.mL -1 PBS (Becton<br />
Dickinson). La plaque <strong>de</strong> culture est alors placée dans l’incubateur à 37 °C pendant 3 heures,<br />
puis sous une hotte à flux laminaire (12 à 24 heures) pour perm<strong>et</strong>tre la polymérisation du<br />
Matrigel. Les inserts sont stockés à 4 °C puis réhydratés 24 heures avant l’expérience avec<br />
500 µl <strong>de</strong> milieu.<br />
Préparation <strong>de</strong>s cellules pour la migration<br />
Les cellules A431 sont ensemencées dans <strong>de</strong>s tubes Falcon T25 à raison <strong>de</strong> 1.7.10 6 -2.10 6<br />
cellules.5 mL -1 par T25 dans du milieu <strong>de</strong> culture à 10 % <strong>de</strong> SVF. Après 24 h, les cellules sont<br />
rincées au PBS puis traitées par <strong>de</strong>s solutions à 50 ou 100 µM <strong>de</strong>s xylanes (dilution dans du<br />
milieu à 10% <strong>de</strong> SVF) pendant 24 h. Des cellules, servant <strong>de</strong> témoins, ne sont pas traitées<br />
(milieu 10 % SVF). Après les traitements par les différents lots <strong>de</strong> xylanes, les cellules sont<br />
rincées au PBS, détachées à la trypsine, puis comptées. Elles sont alors diluées dans du milieu<br />
dépourvu <strong>de</strong> sérum mais additionné <strong>de</strong> 0,1 % <strong>de</strong> BSA.<br />
Préparation <strong>de</strong>s cellules pour l’invasion<br />
Les cellules ne sont pas pré-traitées mais sont placées simultanément au contact <strong>de</strong><br />
solutions à 50 ou 100 µM <strong>de</strong> xylanes dans les inserts.<br />
Migration cellulaire<br />
Les cellules pré-traitées <strong>et</strong> non traitées (témoins) sont déposées dans les inserts recouverts<br />
<strong>de</strong> fibronectine à raison <strong>de</strong> 10.10 4 cellules.500 µL-1 par insert dans du milieu 0,1 % <strong>de</strong> BSA.<br />
Du milieu à 10 % <strong>de</strong> SVF est placé comme chémoattractant dans les puits <strong>de</strong> la plaque<br />
companion (500 µL par puits), afin <strong>de</strong> perm<strong>et</strong>tre la formation d’un gradient chimiotactique <strong>de</strong><br />
part <strong>et</strong> d’autre <strong>de</strong> la membrane poreuse (Figure). Après 24 h <strong>de</strong> migration dans l’incubateur à<br />
37 °C, le surnageant est éliminé <strong>et</strong> les inserts sont rincés au PBS sur chaque face. Les cellules<br />
n’ayant pas migré au travers <strong>de</strong>s pores (face interne <strong>de</strong>s inserts) sont éliminées par grattage<br />
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