Extraction, caractérisation chimique et valorisation biologique de ...
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V.1.2. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la viabilité cellulaire<br />
V.1.2.a. Tests MTT<br />
L’eff<strong>et</strong> <strong>de</strong>s différents composés sur la viabilité cellulaire a été étudié grâce à un test<br />
MTT (bromure <strong>de</strong> 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltétrazolium ; Sigma-Aldrich)). 241<br />
V.1.2.b. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s eff<strong>et</strong>s <strong>de</strong> doses <strong>et</strong> du temps<br />
Les cellules sont ensemencées dans <strong>de</strong>s plaques <strong>de</strong> 96 puits (Falcon) à raison <strong>de</strong> 5.10 3<br />
cellules.100 µL -1 dans du milieu compl<strong>et</strong> (10% <strong>de</strong> SVF). Après 24 h <strong>de</strong> culture, le milieu est<br />
eliminé <strong>et</strong> remplacé par du milieu à 2% <strong>de</strong> SVF contenant <strong>de</strong>s concentrations croissantes <strong>de</strong><br />
produits. Après 72 h <strong>de</strong> traitement, les cellules sont rincées au PBS puis incubées avec 100 µL<br />
<strong>de</strong> MTT (0,2 mg.mL -1 <strong>de</strong> PBS pendant 4h à 37°C <strong>et</strong> 5% <strong>de</strong> CO2. Le MTT réduit en bleu <strong>de</strong><br />
formazan, est solubilisé par l’addition <strong>de</strong> 100 µL <strong>de</strong> DMSO (diméthylsulfoxi<strong>de</strong> ; Sigma-<br />
Aldrich) dans chaque puits. La <strong>de</strong>nsité optique (DO) est mesurée à 595 nm grâce à un lecteur<br />
<strong>de</strong> plaque Labsystem Multiskan MS. Le pourcentage <strong>de</strong> viabilité cellulaire (%V) est<br />
déterminé selon la formule suivante :<br />
%V = [DOcellules traitées/Moy (DOcellules non traitées)]x100<br />
V.1.2.c. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la migration <strong>et</strong> <strong>de</strong> l’invasion cellulaire<br />
L’eff<strong>et</strong> <strong>de</strong>s xylanes a été étudié sur la migration <strong>et</strong> l’invasion <strong>de</strong>s cellules A431 a été<br />
étudié. Pour cela, nous avons utilisé <strong>de</strong>s chambres <strong>de</strong> culture (ou chambre <strong>de</strong> migration)<br />
appelées chambres <strong>de</strong> Boy<strong>de</strong>n (Becton Dickinson). Ces chambres sont composées d’inserts<br />
constitués d’une membrane poreuse (membrane <strong>de</strong> 0,3 cm 2 , pores <strong>de</strong> 8 µm), placés dans <strong>de</strong>s<br />
plaques <strong>de</strong> 24 puits (plaques companions ; Falcon ; Becton Dickinson).<br />
Préparation <strong>de</strong>s inserts pour la migration<br />
Pour l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la migration cellulaire, l’intérieur <strong>de</strong>s inserts (déposés dans les puits <strong>de</strong> la<br />
plaque compagnon) est recouvert <strong>de</strong> 100 µL <strong>de</strong> fibronectine (à 100 µg.mL -1 dans du PBS) par<br />
inserts. Après une nuit à 4 °C, l’excès <strong>de</strong> fibronectine est éliminé, les membranes sont rincées<br />
2 fois au PBS puis saturées 1 heure avec 1% <strong>de</strong> BSA (albumine bovine ; Sigma-Aldrich). Le<br />
milieu avec 1% BSA est finalement éliminé.<br />
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