Extraction, caractérisation chimique et valorisation biologique de ...

V.1.2. Etude de la viabilité cellulaire
V.1.2.a. Tests MTT
L’effet des différents composés sur la viabilité cellulaire a été étudié grâce à un test
MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltétrazolium ; Sigma-Aldrich)). 241
V.1.2.b. Etude des effets de doses et du temps
Les cellules sont ensemencées dans des plaques de 96 puits (Falcon) à raison de 5.10 3
cellules.100 µL -1 dans du milieu complet (10% de SVF). Après 24 h de culture, le milieu est
eliminé et remplacé par du milieu à 2% de SVF contenant des concentrations croissantes de
produits. Après 72 h de traitement, les cellules sont rincées au PBS puis incubées avec 100 µL
de MTT (0,2 mg.mL -1 de PBS pendant 4h à 37°C et 5% de CO2. Le MTT réduit en bleu de
formazan, est solubilisé par l’addition de 100 µL de DMSO (diméthylsulfoxide ; Sigma-
Aldrich) dans chaque puits. La densité optique (DO) est mesurée à 595 nm grâce à un lecteur
de plaque Labsystem Multiskan MS. Le pourcentage de viabilité cellulaire (%V) est
déterminé selon la formule suivante :
%V = [DOcellules traitées/Moy (DOcellules non traitées)]x100
V.1.2.c. Etude de la migration et de l’invasion cellulaire
L’effet des xylanes a été étudié sur la migration et l’invasion des cellules A431 a été
étudié. Pour cela, nous avons utilisé des chambres de culture (ou chambre de migration)
appelées chambres de Boyden (Becton Dickinson). Ces chambres sont composées d’inserts
constitués d’une membrane poreuse (membrane de 0,3 cm 2 , pores de 8 µm), placés dans des
plaques de 24 puits (plaques companions ; Falcon ; Becton Dickinson).
Préparation des inserts pour la migration
Pour l’étude de la migration cellulaire, l’intérieur des inserts (déposés dans les puits de la
plaque compagnon) est recouvert de 100 µL de fibronectine (à 100 µg.mL -1 dans du PBS) par
inserts. Après une nuit à 4 °C, l’excès de fibronectine est éliminé, les membranes sont rincées
2 fois au PBS puis saturées 1 heure avec 1% de BSA (albumine bovine ; Sigma-Aldrich). Le
milieu avec 1% BSA est finalement éliminé.
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