Extraction, caractérisation chimique et valorisation biologique de ...

par passage sur résine Amberlite IR-120 (H + ). Cette solution est alors placée à l'étuve à 100°C
durant des temps variables dépendants de la résistance du polysaccharide à l’hydrolyse. Après
refroidissement, la fraction polymérique pas ou peu hydrolysée est précipitée par 3 volumes
d’éthanol absolu et éliminée par filtration. L’hydrolysat constitué d’oligosaccharides est
concentré par évaporation sous vide.
III.3.2. Séparation des oligosaccharides
Les produits d'hydrolyse ont été séparés par chromatographie d'échange d'ions sur une
colonne de résine basique Dowex 1×2 sous forme Cl - (mesh 200-400 ; Fluka ; colonne : Ø 1
cm × 50 cm). Un gradient d’élution linéaire de formiate d’ammonium de 0,05 M à 0,5 M a été
appliqué pour séparer les oligosaccharides selon leur charge. La purification des fractions
homogènes se poursuit ensuite sur une colonne de Biogel P-2 (100-1800 Da ; Biorad ;
colonne : Ø 2,5 cm × 70 cm) équilibrée dans l’eau sous un débit de 10 mL.h -1 . Les fractions
oligosaccharidiques sont recueillies en sortie de colonne à l’aide d’un collecteur (Redifrac ;
Pharmacia-Biotech.) et contrôlées par CCM (éluant : butanol, acide acétique, eau ; 2/1/1)
après révélation par pulvérisation d’une solution d’H2SO4 20 % à 0,1 % d’orcinol et passage à
l’étuve à 100°C.
III.3.3. Purification des oligosaccharides
L’hydrolysat ainsi obtenu est déposé sur colonne de BioGel P-2 (100-1800 Da ; Biorad ;
colonne : Ø 2,5 cm × 70 cm) et P-4 (800-4000 Da ; Biorad ; colonne : Ø 2,5 cm × 70 cm). Les
oligosaccharides sont élués avec de l’eau distillée sous un débit de 10 mL.h -1 et collectés.
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