caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Exposé bibliographique : La O-fucosyltransférase 1
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Tableau 1 : Constantes cinétiques de l’enzyme Pofut1 purifiée à partir de cellules CHO et de
l’enzyme Pofut1 humaine.
EGF-1 du facteur VII
(substrat accepteur)
GDP-fucose
(substrat donneur)
Pofut1 des cellules CHO Pofut1 humaine
Km (µM) Vmax (µmol/min/mg) Km (µM) Vmax (µmol/min/mg)
11 6
5,9-6,4
2,5
Après purification de l'enzyme Pofut1, sa glycosylation a pu être mise en évidence
après une digestion par la PNGase F (Wang et Spellman, 1998). Cette enzyme coupe les Nglycanes
oligomannosidiques, hybrides et complexes entre l'asparagine de la chaîne
peptidique et la première GlcNAc. La masse moléculaire de Pofut1 passe alors de 44 à 40
KDa, ce qui suggère la présence de N-glycanes d’une masse moléculaire totale de 4 KDa. Une
digestion avec l'endoglycosidase H, qui coupe entre les deux résidus GlcNAc proximaux, à la
fois les N-glycanes oligomannosidiques et certains N-glycanes hybrides, donne en western
blot deux bandes. Elles correspondent à des formes protéiques de masses inférieures à la
forme glycosylée. Elles seraient une forme monoglycosylée et une forme déglycosylée de
l’enzyme Pofut1. Ainsi, les auteurs concluent que l'enzyme Pofut1 extraite des cellules CHO
est une glycoprotéine porteuse de plus d'un oligosaccharide de type oligomannosidique.
Toutefois, il ne faut pas écarter l’hypothèse que ces N-glycanes puissent être de type hybride.
2.1.2.3 Identification du gène correspondant, Pofut1
Suite à la purification et au séquençage peptidique de Pofut1 extraite de cellules CHO,
Wang et ses collaborateurs (2001), en s’appuyant sur la séquence N-terminale et sur une
recherche d’homologie dans les banques de données, ont pu identifier un EST (Expressed
sequence Tag) humain correspondant à cette enzyme. L'ADNc code une protéine de 388
acides aminés et possède deux sites potentiels de N-glycosylation (Wang, Shao et al., 2001).
Le transcrit de plus de 5 Kb possède une longue partie 3' non traduite, typique de nombreuses
glycosyltransférases (Breton et Imberty, 1999), et deux sites potentiels de polyadénylation
pouvant expliquer la présence de deux des signaux obtenus en northern blot (Wang, Shao et
al., 2001). Cependant, d’autres marquages sur ce même northern blot laisse présager de
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