caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Exposé bibliographique : La O-fucosyltransférase 1
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2.1.2 Caractérisation de l’enzyme Pofut1
2.1.2.1 Identification de l’activité O-fucosyltransférase 1
Comme nous l'avons vu précédemment, la protéine O-fucosyltransférase 1 ou Pofut1
est responsable du greffage du O-fucose sur les domaines EGF de certaines protéines
possédant le motif consensus de O-fucosylation, C 2 X4-5(S/T)C 3 . La démarche scientifique qui
a amené à la caractérisation de cette enzyme a débuté avec la mise au point en 1996 d’un test
in vitro de mesure de l’activité O-fucosyltransférase 1 (Wang et al., 1996). Le test utilise
comme substrat donneur du GDP-L-fucose (substrat donneur de toutes les
fucosyltransférases), comme substrat accepteur le premier domaine EGF du facteur de
coagulation VII humain et un cation divalent. En effet, la présence de ce dernier est nécessaire
à l’activité de nombreuses glycosyltransférases (Munro and Freeman, 2000). Dans le cas de
Pofut1, plusieurs types de cations divalents ont été testés; c’est avec du manganèse (Mn2 + )
que l’activité enzymatique est la plus forte (Wang et al., 1996).
Ainsi, une première activité O-fucosyltransférase 1 a pu être mesurée à partir d’extraits
protéiques de cellules CHO et de cellules hépatiques de rat (Wang et al., 1996). Les auteurs
ont également montré que le transfert du O-fucose n’est possible que sur un domaine EGF
complet, c'est-à-dire possédant ses six résidus cystéines nécessaires à l’acquisition de sa
structure tridimensionnelle (Fig.10A.).
2.1.2.2 Purification de l'enzyme
Suite à la mise au point du test d'activité, Wang et Spellman (1998) ont purifié
l’enzyme Pofut1 à partir de cellules CHO. En se basant sur l'activité enzymatique déjà
déterminée et sur l'affinité de l'enzyme pour ses substrats (donneur et accepteur), les auteurs
ont utilisé deux étapes de chromatographie d’affinité. La première colonne utilisée contenait
l’EGF du facteur VII humain et la deuxième colonne, du GDP-hexanolamine-Sépharose
comme substrat donneur. Ils ont ainsi purifié et déterminé les constantes cinétiques de Pofut1
(référencées dans le Tableau 1). L'enzyme O-fucosyltransférase 1 représente environ 0,02%
des protéines totales des cellules CHO, taux rarement atteint pour une glycosyltransférase.
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