caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Conclusion et perspectives
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L’enzyme Pofut1 bovine possède deux sites de N-glycosylation : le premier N 65 est
conservé chez tous les Bilatériens (sauf chez les Nématodes C. elegans, C. briggsae et S. ratti,
et un Insecte H. coagulata); le second N 163 n’est présent que chez les Mammifères et l’Insecte
B. mori. Dans une première étape, nous nous sommes attachés à montrer que l’enzyme bovine
était bien diglycosylée. Puis, par des expériences de mutagenèse dirigée, nous avons montré
que si l’occupation du deuxième site de N-glycosylation ne semble pas indispensable au
maintien de l’activité enzymatique, le premier N-glycane est absolument nécessaire au
repliement correct de la protéine. En effet, sans le premier site de N-glycosylation, l’enzyme
Pofut1 est mal conformée et s’agrège dans le RE. Etant donné la conservation de ce premier
site de N-glycosylation chez pratiquement toutes les espèces étudiées jusqu’à présent et la
mauvaise conformation de l’enzyme dépourvue de ce N-glycane, il n’est pas étonnant que
celle-ci ait perdu toute activité enzymatique. D’autres expériences de mutagenèse dirigée sur
des acides aminés conservés entre les espèces, comme par exemple, ceux inclus dans les
motifs I, II et III sont envisagées au laboratoire et pourront compléter les données sur la
relation structure/fonction de la O-fucosyltransférase 1.
Plus récemment, nous avons commencé un travail visant à appréhender le rôle
potentiel de l’enzyme Pofut1 au cours de la différenciation in vitro de cellules myoblastiques.
Pour ceci, deux voies de recherche ont été engagées simultanément. D’une part, nous avons
mis en place au laboratoire une culture primaire de myoblastes bovins. Il a donc fallu mettre
au point et maîtriser les différentes étapes techniques comme le prélèvement du tissu
musculaire d’embryons, l’isolement, la culture, le tri et la différenciation des myoblastes.
D’autre part, nous avons débuté une étude similaire sur les cellules de la lignée myoblastique
murine C2C12. Le but d’un tel dispositif est de mettre en évidence les répercussions d’une
surexpression ou d’une inhibition de l’expression du gène Pofut1 sur la différenciation in vitro
de myoblastes en myotubes. Ces études reposent sur la transfection des cellules avec un
vecteur d’expression eucaryote permettant la surexpression transitoire de l’enzyme Pofut1
(bovine ou murine selon l’origine des myoblastes) ou avec un vecteur de shRNA permettant
la dégradation des transcrits Pofut1. Elles nécessitent la mise en place de cinétiques de
différenciation de cellules transfectées et non transfectées. Des expériences de RT-PCR semiquantitative
et de western blot permettent d’analyser les niveaux d’expression des transcrits et
des protéines, pour Pofut1 et pour des marqueurs myogéniques, en l’occurrence les principaux
membres de la famille de facteurs de transcription à domaine bHLH (Myf5, MyoD, Myogénine
et MRF4).
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