caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Annexe III : Matériels et Méthodes
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8,8 µL d’eau; tous les points sont réalisés en triplicat. La PCR est exécutée par l’appareil
Applied Biosystems 7900HT : Fast real time PCR System (plaque 96(384)~1h30/PCR). Lors
de la PCR en temps réel, les étapes d’amplification sont les mêmes que lors de la PCR
classique, c’est à dire, dénaturation, hybridation et élongation. L’émission de la fluorescence à
chaque cycle, induite par la libération du « Reporter » par la polymérase, permet de détecter et
visualiser les amplicons. L’analyse de la courbe d’amplification va permettre de déterminer la
quantité de cibles présentes en début de réaction. La ligne de seuil est positionnée
manuellement au-dessus du bruit de fond et au niveau de la phase exponentielle.
L’intersection de la courbe d’amplification et de la ligne de seuil désigne un cycle ou Ct
(Threshold Cycle) par projection sur l’axe des abscisses (Fig.74.). Le Ct est inversement
proportionnel au nombre de cibles amplifiées initialement présentes dans le milieu
réactionnel. Ainsi, deux échantillons ayant un nombre de copies différents auront 2 Ct
différents.
Figure 74 : Représentation d’une amplification par PCR en temps réel, d’un fragment d’ADN
sur une échelle logarithmique.
L’axe des abscisses correspond au nombre de cycles (Ct) et l’axe des ordonnées à l’augmentation de la
fluorescence (Delta Rn), directement proportionnelle à la quantité de produit amplifié.
L’un des intérêts de la PCR en temps réel est le contrôle du rendement
d’amplification. Théoriquement, pour un rendement de 100%, le nombre de copies de la
séquence cible double à chaque cycle. Cependant, il est rare d’obtenir un tel rendement. Ainsi,
une relation permet d’obtenir le nombre de copies (Xn) à un cycle donné (n) à partir d’un
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