caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Annexe III : Matériels et Méthodes
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Tri des myoblastes au FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)
48 heures après la mise en culture, les cellules sont lavées par du PBS 1X (13,7mM
NaCl, 0,27mM KCl, 0,43mM Na2HPO4-7H2O et 0,14mM KH2PO4), après élimination du
milieu de culture par aspiration. Elles sont ensuite décollées de leur support par action de la
trypsine (PBS 1X, EDTA 1mM, trypsine 0,05% (p/v)), pendant 3min à 37°C. L’action de la
trypsine est stoppée par addition de milieu DMEM complet. Une série
d’aspiration/refoulement permet de décoller les cellules encore adhérentes. La totalité des
cellules est récupérée par centrifugation (1200t/min, 5min). Elles sont reprises dans 20mL de
PBS 1X, comptées, aliquotées par 5.10 5 (autant de tubes que de cellules désirées) et de
nouveau centrifugées (1200t/min, 10min). Les culots sont repris dans 90µL de PBS 1X
additionné de 10µL d’anticorps anti-CD56 (couplé PE) (Becton-Dickinson, Le Pont de Claix,
France) ou d’anticorps isotypique (couplé FITC, témoin négatif) (Becton-Dickinson).
L’incubation est de 20min à 4°C. Les cellules sont rincées à plusieurs reprises dans du PBS
1X. Après une centrifugation finale, elles sont reprises dans 2mL de PBS 1X. La fluorescence
est analysée au FACS et les cellules reconnues par l’anticorps anti-CD56 (les myoblastes)
sont triées stérilement par le cytomètre, puis remises en culture en milieu complet.
Pour la différenciation des myoblastes bovins en myotubes, il faut que les cellules
soient entre 80 et 90% de confluence. On remplace alors le milieu de culture par du milieu de
différenciation (DMEM complété avec 2% de sérum de cheval, 2mM de L-glutamine,
50U/mL de pénicilline et 50µg/mL de steptomycine, 0,001% (p/v) d’insuline et 0,0005%
(p/v) d’apo-transférine); les premiers myotubes sont observables au bout de 72 heures.
Marquage avec l’anticorps anti-laminine
Les myoblastes bovins sont mis en culture à une densité de 10 6 cellules, dans une boîte
de 100mm de diamètre dont le fond a été recouvert de lamelles de microscopie, puis de
gélatine. Quand les cellules sont entre 80 et 90% de confluence, le milieu de culture est aspiré
et remplacé par du milieu de différenciation. Quand elles ont fusionné pour former des
myotubes, le milieu de différenciation est aspiré et les cellules sont fixées avec de l’éthanol
froid 100%, pendant 4min à 4°C. Elles sont ensuite lavées 5min à deux reprises avec du PBS
1X, puis perméabilisées 10min à température ambiante avec une solution de TritonX100 (PBS
1X, 1% TritonX100 (v/v)), suivi de deux nouveaux lavages de 5min au PBS 1X. La saturation
a lieu 30min à température ambiante (PBS 1X, 10% FCS (v/v)). Les cellules sont ensuite
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