caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Etude du rôle de Pofut1 dans la différenciation de cellules C2C12
__________________________________________________________________________________________
Figure 69 : Analyse en RT-PCR semi-quantitative des transcrits de Pofut1 dans les cellules
C2C12 non transfectées (marron) et dans le cellules transfectées avec la construction
pcDNA/TOPO3.1-Pofut1 murin (jaune).
Le gène Pofut1 est faiblement exprimé dans les cellules C2C12 quel que soit leur état
de différenciation. En effet, les premières amplifications ne sont détectées qu’au terme
d’environ 31 cycles de PCR (Ct). Le logiciel analysant les résultats des RT-PCR qantitatives
considère qu’un gène n’est pas exprimé, ou très faiblement, lorsque des amplifications ne sont
détectées qu’au terme de 33 Ct. Dans les cellules transfectées avec la construction
pcDNA/TOPO3.1-Pofut1 murin, en fixant comme référence zéro le niveau d’expression
détectée dans les cellules non transfectées, on remarque une forte expression des transcrits
Pofut1 dans les heures suivant la transfection (T0 à T24). A T6, le facteur de surexpression est
d’environ 80X. Comme nous avons choisi d’effectuer des transfections transitoires, le
plasmide utilisé ne s’intègre donc pas dans leur génome de la cellule. Il se dégrade donc
rapidement et se dilue à mesure que les cellules se divisent. L’expression des transcrits Pofut1
décroît donc par la suite pour revenir à son niveau basal à T72.
Une étude par western blot avec l’anticorps anti-Pofut1, sur des extraits protéiques
totaux de cellules C2C12 correspondant à tous les points de la cinétique (transfectées et non
transfectées), est actuellement en cours au laboratoire. Une analyse préliminaire effectuée sur
des lysats cellulaires, 30 heures après transfection (T6), confirme l’expression de la protéine
Pofut1 recombinante par rapport à un extrait protéique de cellules non transfectées (Fig.70.).
206