caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Etude du rôle de Pofut1 dans la différenciation de cellules C2C12
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3.2.3 Premiers résultats obtenus
3.2.3.1 Surexpression de Pofut1 dans les cellules C2C12
3.2.3.1.1 Transfection et induction de la différenciation
Dans le but d’appréhender le rôle de l’enzyme Pofut1 dans la différenciation des
cellules C2C12, 11 millions de cellules ont été nucléoporées avec la construction
pcDNA/TOPO3.1-Pofut1 murin, puis remises en culture dans 11 flasques de culture cellulaire
de 25cm 2 , à raison de 1 million de cellules par flasque. En parallèle, des cellules non
transfectées, sont remises en culture de la même façon. La mise en milieu de différenciation
s’effectue 24 heures après la transfection. Au même moment, des cellules transfectées et des
cellules non transfectées sont décollées et congelées, elles représentent le temps zéro de
l’expérience noté T0. De même, des cellules transfectées et des cellules non transfectées sont
collectées et congelées à différents temps après la mise en milieu de différenciation. Les
différents points, T6, T12, T18, T24, T48, T72, T96, T120, T192 et T264 heures, on été choisi
de façon à couvrir les différentes étapes de la différenciation de 0% à 100% de myotubes.
3.2.3.1.2 Vérification de l’expression de Pofut1
Dans un premier temps, les ARN totaux sont extraits des cellules C2C12 (RNeasy
Mini Kit, QIAGEN, Les Ulis, France). La qualité et la concentration des ARN sont vérifiées
grâce au system Agilent, technologie dont le principe est la microphorèse capillaire sur puce.
Dix microgrammes de ces ARN sont ensuite rétro-transcrits (High capacity cDNA Archive
Kit, Applied Biosystems, Norwalk, USA).
L’expression des transcrits Pofut1 est vérifiée par RT-PCR semi-quantitative en temps
réel. L’analyse est effectuée, en triplicat, sur les 11 points des deux cinétiques (Fig.69.).
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