caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Etude du rôle de Pofut1 dans la différenciation de cellules C2C12
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Figure 68 : Principe de la PCR semi-quantitative en temps réel avec une sonde TaqMan.
La méthode de détection à partir de la sonde TaqMan est basée sur l’utilisation de
l’activité exonucléasique 5’-3’ de l’enzyme Taq polymérase. Les sondes sont marquées par un
« Reporter » qui émet de la florescence uniquement s’il est suffisamment loin d'un
« Quencher ». En effet, le Quencher a la propriété d'absorber l'énergie émise par le Reporter,
par un mécanisme appelé FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert). Lorsque
l'enzyme synthétise un nouveau brin, la sonde est hydrolysée; le reporter se retrouve alors en
solution et il émet dans sa longueur d’onde caractéristique. Cette technique présente
l'avantage d'être plus spécifique par rapport à une PCR classique, de par la présence de la
sonde supplémentaire, et de permettre la détection de plusieurs cibles simultanément en
utilisant des Reporters qui émettent à des longueurs d’onde différentes.
Etant donné la forte homologie entre les enzymes Pofut1 bovine et murine, des
expériences de western blot avec l’anticorps anti-Pofut1, nous permettront également de
vérifier l’expression de la protéine Pofut1 dans les cellules C2C12 transfectées et non
transfectées.
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