caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Etude du rôle de Pofut1 dans la différenciation de cellules C2C12
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Les expériences de transfection avec le vecteur de shRNA (pSuper-RNAi de 5,4 Kb)
ne nous ont pas permis d’obtenir un pourcentage suffisant de cellules transfectées, puisqu’il
est seulement d’environ 7%. Ce vecteur n’ayant pas une taille trop importante, il est possible
que le faible taux de cellules exprimant l’eGFP résulte de la présence du promoteur PGK
(Phosphoglycérate kinase). Tout comme le CMV, il s’agit d’un promoteur ubiquitaire fort; il
est cependant envisageable que celui-ci ne soit pas un promoteur optimal pour les C2C12.
Pour vérifier cette hypothèse, des expériences de remplacement de ce promoteur par celui du
CMV sont actuellement en cours au laboratoire.
3.2.2.2 Utilisation d’autres vecteurs
Etant donné les difficultés rencontrées avec l’utilisation de vecteurs permettant
l’expression de l’eGFP ou la lGFP, et donc le tri des cellules, nous avons décidé de continuer
notre étude avec les vecteurs pcDNA/TOPO3.1 pour la surexpression et pSilencer (Fig.60.)
pour la sous-expression.
Dans le vecteur pcDNA/TOPO3.1, l’expression de la protéine Pofut1 est sous le
contrôle du promoteur CMV. L’expression du shRNA dans le pSilencer est sous le contrôle
du promoteur U6. Ces deux promoteurs forts permettent l’expression transitoire dans de très
nombreux types cellulaires.
Ces vecteurs ne contenant pas de CDS codant une protéine fluorescente, il nous est
impossible de déterminer le taux de transfection cellulaire. Cependant, nous avons vérifié,
dans les deux cas, le niveau d’expression des transcrits de Pofut1 murin par RT-PCR semiquantitative
en temps réel (Fig.68.), grâce à l’utilisation d’une sonde TaqMan (Applied
Biosystems, Norwalk, USA) spécifique du transcrit.
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