caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

1.2.2 Production d’anticorps anti-Pofut bovins................................................................................... 134
1.2.3 Activités des protéines codées par les différents variants ........................................................... 138
1.2.4 Evolution des gènes de O-fucosyltransférases ............................................................................ 143
1.2.5 Synthèse et conclusion................................................................................................................. 152
2 CONSERVATION DES SITES DE N-GLYCOSYLATION DE POFUT1, RELATION
STRUCTURE/FONCTION ............................................................................................................................. 169
2.1 PUBLICATION 2................................................................................................................................. 173
2.2 RESULTATS COMPLEMENTAIRES....................................................................................................... 175
2.2.1 Expression tissulaire de l’enzyme bovine Pofut1 ........................................................................ 175
2.2.2 Expression tissulaire de l’enzyme bovine Pofut2 ........................................................................ 178
2.2.3 Synthèse et conclusion................................................................................................................. 181
3 POFUT1 : UN ROLE DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES MUSCULAIRES EN
CULTURE ?...................................................................................................................................................... 183
3.1 MISE EN PLACE DE LA CULTURE PRIMAIRE DE CELLULES SATELLITES BOVINES ET DES VECTEURS
D’EXPRESSION EUCARYOTE............................................................................................................................. 187
3.1.1 Isolement, culture et différenciation............................................................................................ 187
3.1.2 Construction des vecteurs eucaryotes pour les transfections...................................................... 189
3.1.2.1 Vecteur de surexpression................................................................................................... 189
3.1.2.2 Vecteur de shRNA............................................................................................................. 191
3.1.3 Transfection des cellules bovines en culture primaire ................................................................ 194
3.2 ETUDE DU ROLE DE POFUT1 DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES C2C12 ................................ 199
3.2.1 Construction du vecteur de surexpression .................................................................................. 199
3.2.2 Culture et transfection................................................................................................................. 200
3.2.2.1 Difficultés rencontrées....................................................................................................... 200
3.2.2.2 Utilisation d’autres vecteurs .............................................................................................. 203
3.2.3 Premiers résultats obtenus.......................................................................................................... 205
3.2.3.1 Surexpression de Pofut1 dans les cellules C2C12 ............................................................. 205
3.2.3.1.1 Transfection et induction de la différenciation ............................................................. 205
3.2.3.1.2 Vérification de l’expression de Pofut1.......................................................................... 205
3.2.3.1.3 Répercussion de la surexpression de Pofut1 sur l’expression des facteurs myogéniques
bHLH ...................................................................................................................................... 210
3.2.3.2 Inhibition de l’expression de Pofut1.................................................................................. 214
3.3 MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................... 215
Réaction de PCR ............................................................................................................................. 217
Méthodes relatives aux cellules....................................................................................................... 217
Dosage des ARN ............................................................................................................................. 220
RT-PCR semi-quantitative en temps réel ........................................................................................ 220
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................... 223
NOUVEAU CHAPITRE DE LA THESE .......................................................................... 229
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................... 243