caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Etude du rôle de Pofut1 dans la différenciation de cellules C2C12
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3.2 Etude du rôle de Pofut1 dans la différenciation
de cellules C2C12
Dans le but d’appréhender le rôle joué par l’enzyme Pofut1 au cours de la
différenciation de cellules myoblastiques murines de la lignée C2C12, il nous a fallu, dans un
premier temps, construire les outils moléculaires nécessaires aux transfections. En
l’occurrence, un vecteur de surexpression contentant le CDS de Pofut1 murin. Le vecteur de
shRNA précédemment construit (Fig.61.) contenant une séquence homologue aux séquences
bovine et murine pourra nous être utile dans cette étude.
3.2.1 Construction du vecteur de surexpression
Grâce à la sélection d’amorces spécifiques de part et d’autre du CDS de Pofut1 murin,
nous avons pu isoler, par PCR, l’ADNc codant la forme active de l’enzyme en utilisant
comme matrice des ADNc de cœur obtenus après extraction et rétro-transcription d’ARN
totaux. Le gène Pofut1 étant suffisamment exprimé chez la souris, une PCR primaire suffit.
Afin de cloner l’ADN amplifié dans le vecteur pVITRO2-lGFP, nous avons utilisé une
amorce en 5’ possédant le site de restriction de l’enzyme BglII (souligné) et la séquence
Kozak de Pofut1 murin (Pofut1-Mus-BglII : 5’-AGATCTGTCGACATGGGCGCCGCC-3’), et
une amorce en 3’ complémentaire à la région terminale du CDS, comportant le codon stop
(Pofut1-Mus-CDS3’ : 5’-TCAAAATTCATCCCGAAGCTGGGAGG-3’). L’amplification obtenue
a tout d’abord été clonée dans le pcDNA/TOPO3.1. La double digestion de ce vecteur par
BglII et XhoI autorise ensuite la ligature de l’insert dans le vecteur pVITRO2-lGFP linéarisé
par ces mêmes enzymes.
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