caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Mise en place de la culture primaire de myoblastes bovins et des vecteurs
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Nous avons souhaité commencer notre étude par la surexpression de Pofut1A avec le
vecteur pVITRO2-lGFP/Pofut1a bovin. Avant toute analyse, il est nécessaire d’avoir
suffisamment de cellules transfectées, de façon à pourvoir les trier grâce à l’expression de la
lGFP, et les remettrent en culture. Pour effectuer notre cinétique de différenciation, il nous
faut 11 boîtes de cellules transfectées (flasques de 25cm 2 ou boîtes de 100mm de diamètre
pour que la différenciation se passe normalement et soit observable) qui seront mises en
milieu de différenciation une fois les 80% de confluence atteints. Les cellules seront donc
récupérées à 11 temps différents recouvrant toutes les étapes de la différenciation de 0% à
100% de myotubes.
Nous avons essayé plusieurs techniques de transfection, notamment grâce à
l’utilisation de polymères cationiques comme le jetPEI (polyéthylènimine, Polyplus-
Transfection, Illkirch, France) ou le PolyFect (PolyFect Transfection Reagent, QIAGEN, Les
Ulis, France). Seules les transfections effectuées avec des liposomes (lipofection, Fugene6,
Roche diagnostics, Meylan, France) nous ont permis d’obtenir un pourcentage de cellules
transfectées entre 3 et 4% (Fig.62A.), taux plus faible que celui auquel nous nous attendions.
De plus, un premier essai de repiquage de ces cellules transfectées et triées montre qu’au
cours de leur prolifération, elles perdent progressivement l’expression de la lGFP (Fig.62B et
C.).
Figure 62 : Cytogrammes biparamétriques (rapport taille vs fluorescence) obtenus lors d’une
expérience de tri cellulaire après transfection de culture primaire de myoblastes bovins.
A, tri cellulaire 24 heures après transfection avec le plasmide pVITRO2-lGFP/Pofut1a bovin. Seulement 3,29%
des cellules expriment la lGFP. Après tri stérile, ces cellules sont remises en culture dans deux boîtes de 60mm
de diamètre; B, passage au FACS des cellules d’une des deux boîtes 24 heures après tri. 85,29% de cellules
expriment toujours la lGFP; C, passage au FACS des cellules de la seconde boîte 48 heures après le tri. Il n’y a
plus que 55,81% de cellules qui expriment la lGFP. R1 : pourcentage de cellules prises en compte, R2 :
pourcentage de cellules exprimant la lGFP.
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