caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Mise en place de la culture primaire de myoblastes bovins et des vecteurs
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Figure 60 : Vecteur pSilencer 2.1-U6 de shRNA.
Le vecteur contient un fragment (19 pb) de séquence en sens (bleu) et en antisens (vert), homologue à une région
de l’exon 3 du gène Pofut1 murin. L’expression de l’insert est sous le contrôle du promoteur U6.
L’identité parfaite de l’insert avec une portion de la séquence bovine et son efficacité
dans l’extinction de l’expression d’ARN Pofut1 dans les cellules CHO (communication
personnelle de P. Stanley) nous ont motivé pour l’utiliser. Néanmoins, ce vecteur ne
possédant pas de marqueur permettant de contrôler le taux de transfection et de trier les
cellules, nous avons entrepris le clivage de l’insert par les enzymes de restrictions BamHI et
HindIII, de façon à l’insérer au niveau des sites de restrictions BglII (isoschizomère de
BamHI) et HindIII du vecteur pSuper-RNAi (OligoEngine, Seattle, USA) (Fig.61.). Etant
donné la faible taille de l’insert, nous n’avons pas réussi à l’isoler même par l’intermédiaire
d’une migration sur un gel d’acrylamide. Nous avons donc reconstruit l’insert en utilisant
deux amorces complémentaires avec chacune une extrémité débordante, correspondant au site
de restriction désiré (siRNA1 : 5’-
GATCCCGTCCTGATAAGAAGACATGTTCAAGAGACATGTCTTCTTATCAGGACTTTTTTGGA
AA-3’; siRNA2 : 5’-AGCTTTTCCAAAAAAGTCCTGATAAGAAGACATGTCTCTTG
AACATGTCTTCTTATCAGGACGA-3’). Celles-ci ont été hybridées 10min à 96°C, puis le
mélange a ensuite été ligaturé dans le vecteur pSuper-RNAi précédemment clivé par les
enzymes de restriction BglII et HindIII. La vérification de la présence de l’insert a été réalisée
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