caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...
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Résultats-Discussion : Mise en place de la culture primaire de myoblastes bovins <strong>et</strong> <strong>des</strong> vecteurs<br />
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taux de transfection <strong>et</strong> de trier en cytométrie de flux, les cellules effectivement transfectées. A<br />
la suite <strong>du</strong> tri, les cellules transfectées sont remises en culture <strong>et</strong> leur différenciation in<strong>du</strong>ite 24<br />
heures plus tard. Onze flasques sont ensemencées afin de suivre la cinétique de<br />
différenciation. Les répercussions de la surexpression de Pofut1 sur la différenciation d’une<br />
population homogène de cellules peuvent alors être observée.<br />
Le choix <strong>du</strong> vecteur d’expression n’a pas été simple. En eff<strong>et</strong>, fusionner la protéine<br />
Pofut1A recombinante directement au marqueur fluorescent (que se soit en N ou C-terminal)<br />
entraîne une perte totale de l’activité O-fucosyltransférase.<br />
Notre choix s’est donc porté sur le vecteur pVITRO2-lGFP (Cayla-InvivoGen,<br />
Toulouse, France) (Fig.58.).<br />
Figure 58 : Vecteur choisi pour la surexpression de l’enzyme Pofut1A dans les cellules<br />
primaires de muscle bovin.<br />
Ce vecteur possède deux sites multiples de clonage (mcs). Au mcs1, nous avons demandé à l’entreprise<br />
InvivoGen de cloner le CDS <strong>du</strong> transcrit codant la lGFP (un dérivé de la GFP) excitable à 488nm. Au mcs2,<br />
nous avons cloné le CDS <strong>du</strong> transcrit bovin Pofut1a codant la forme active de la O-fucosyltransférase 1.<br />
Ce vecteur possède deux promoteurs composites nommés hFer/m-chEF1. Ils résultent<br />
de l’association entre le promoteur ubiquitaire de la ferritine humaine <strong>et</strong> la région 5’UTR <strong>du</strong><br />
gène EF1 de la souris (promoteur avant le mcs1) ou <strong>du</strong> chimpanzé (promoteur avant le mcs2).<br />
Ainsi, l’activation <strong>du</strong> promoteur est constitutive <strong>et</strong> non régulée par le taux de fer. Ils sont de<br />
plus renforcés respectivement par l’enhancer <strong>du</strong> promoteur <strong>du</strong> SV40 ou <strong>du</strong> CMV. Ces deux<br />
promoteurs constitutifs vont perm<strong>et</strong>tre l’expression au sein <strong>des</strong> cellules eucaryotes<br />
transfectées, de deux protéines distinctes, d’une part la lGFP dont les longueurs d’onde<br />
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