caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...
caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ... caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...
2.1.3 Rôles du O-fucose des domaines EGF .......................................................................................... 55 2.2 DECOUVERTE RECENTE D’UNE ENZYME HOMOLOGUE A POFUT1, LA O-FUCOSYLTRANSFERASE 2 ..... 63 2.2.1 Une seconde cible de la O-fucosylation, les TSR .......................................................................... 63 2.2.1.1 Protéines possédant des TSR O-fucosylés........................................................................... 63 2.2.1.2 Formation du O-fucosylglycane porté par les TSR ............................................................. 64 2.2.2 Caractérisation de l’enzyme Pofut2 ..............................................................................................65 2.2.2.1 Identification de l’activité O-fucosyltransférase 2............................................................... 65 2.2.2.2 Etablissement de la structure du gène Pofut2 ...................................................................... 66 2.2.2.3 Localisation sub-cellulaire de l’enzyme Pofut2................................................................... 68 2.2.3 Rôles du O-fucose des domaines TSR ........................................................................................... 68 2.3 CARACTERISTIQUES MOLECULAIRES ET FONCTIONNELLES DES O-FUCOSYLTRANSFERASES............... 71 2.4 EXISTE T’IL UNE TROISIEME O-FUCOSYLTRANSFERASE ?.................................................................... 75 2.5 O-FUCOSYLATION ET DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE.................................................................... 77 POURQUOI GLYCOSYLATION ET MYOGENESE ? ................................................................................ 81 3 LA MYOGENESE DU MUSCLE SQUELETTIQUE ........................................................................... 89 3.1 ORIGINE EMBRYONNAIRE DU MUSCLE SQUELETTIQUE........................................................................ 93 3.2 DETERMINATION MYOGENIQUE .......................................................................................................... 97 3.2.1 Détermination et migration des prémyoblastes............................................................................. 97 3.2.2 Différenciation des précurseurs musculaires................................................................................ 99 3.2.2.1 Les protéines à domaine bHLH ........................................................................................... 99 3.2.2.1.1 Facteurs myogéniques (MRFs) ....................................................................................... 99 3.2.2.1.2 Cinétiques d'expression................................................................................................. 100 3.2.2.1.3 Activités........................................................................................................................ 101 3.2.2.2 Les protéines à domaine MADS........................................................................................ 104 3.2.2.2.1 Facteur de réponse au sérum (SRF) .............................................................................. 104 3.2.2.2.2 Famille des Myocyte Enhancer Factors 2 (MEF2) ....................................................... 105 3.3 EFFECTEURS DE LA MYOGENESE....................................................................................................... 107 3.3.1 Les inducteurs ............................................................................................................................. 107 3.3.1.1 La famille des Insulin-like growth factors (IGFs) ............................................................. 107 3.3.1.2 La famille Wingless (WNTs)............................................................................................. 108 3.3.2 Les inhibiteurs............................................................................................................................. 109 3.3.2.1 La famille des Transforming growth factors β (TGFβ) ..................................................... 109 3.3.2.2 La famille des Fibroblast growth factors (FGFs)............................................................... 110 3.3.2.3 Notch et ses ligands ........................................................................................................... 111 3.4 LA MYOGENESE IN VITRO .................................................................................................................. 115 RESULTATS-DISCUSSION .............................................................................................. 117 1 EVOLUTION DES GENES DE O-FUCOSYLTRANSFERASES. STRUCTURE ET EXPRESSION DES GENES POFUT1 ET POFUT2 CHEZ BOS TAURUS.......................................................................... 121 1.1 PUBLICATION 1................................................................................................................................. 125 1.2 RESULTATS COMPLEMENTAIRES....................................................................................................... 129 1.2.1 Expression tissulaire des variants transcriptionnels................................................................... 129
1.2.2 Production d’anticorps anti-Pofut bovins................................................................................... 134 1.2.3 Activités des protéines codées par les différents variants ........................................................... 138 1.2.4 Evolution des gènes de O-fucosyltransférases ............................................................................ 143 1.2.5 Synthèse et conclusion................................................................................................................. 152 2 CONSERVATION DES SITES DE N-GLYCOSYLATION DE POFUT1, RELATION STRUCTURE/FONCTION ............................................................................................................................. 169 2.1 PUBLICATION 2................................................................................................................................. 173 2.2 RESULTATS COMPLEMENTAIRES....................................................................................................... 175 2.2.1 Expression tissulaire de l’enzyme bovine Pofut1 ........................................................................ 175 2.2.2 Expression tissulaire de l’enzyme bovine Pofut2 ........................................................................ 178 2.2.3 Synthèse et conclusion................................................................................................................. 181 3 POFUT1 : UN ROLE DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES MUSCULAIRES EN CULTURE ?...................................................................................................................................................... 183 3.1 MISE EN PLACE DE LA CULTURE PRIMAIRE DE CELLULES SATELLITES BOVINES ET DES VECTEURS D’EXPRESSION EUCARYOTE............................................................................................................................. 187 3.1.1 Isolement, culture et différenciation............................................................................................ 187 3.1.2 Construction des vecteurs eucaryotes pour les transfections...................................................... 189 3.1.2.1 Vecteur de surexpression................................................................................................... 189 3.1.2.2 Vecteur de shRNA............................................................................................................. 191 3.1.3 Transfection des cellules bovines en culture primaire ................................................................ 194 3.2 ETUDE DU ROLE DE POFUT1 DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES C2C12 ................................ 199 3.2.1 Construction du vecteur de surexpression .................................................................................. 199 3.2.2 Culture et transfection................................................................................................................. 200 3.2.2.1 Difficultés rencontrées....................................................................................................... 200 3.2.2.2 Utilisation d’autres vecteurs .............................................................................................. 203 3.2.3 Premiers résultats obtenus.......................................................................................................... 205 3.2.3.1 Surexpression de Pofut1 dans les cellules C2C12 ............................................................. 205 3.2.3.1.1 Transfection et induction de la différenciation ............................................................. 205 3.2.3.1.2 Vérification de l’expression de Pofut1.......................................................................... 205 3.2.3.1.3 Répercussion de la surexpression de Pofut1 sur l’expression des facteurs myogéniques bHLH ...................................................................................................................................... 210 3.2.3.2 Inhibition de l’expression de Pofut1.................................................................................. 214 3.3 MATERIELS ET METHODES ............................................................................................................... 215 Réaction de PCR ............................................................................................................................. 217 Méthodes relatives aux cellules....................................................................................................... 217 Dosage des ARN ............................................................................................................................. 220 RT-PCR semi-quantitative en temps réel ........................................................................................ 220 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................... 223 NOUVEAU CHAPITRE DE LA THESE .......................................................................... 229 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................... 243
- Page 1: UNIVERSITE DE LIMOGES ECOLE DOCTORA
- Page 7: A mes parents, A Lionel.
- Page 10 and 11: gentillesse. Merci Carole pour ton
- Page 12 and 13: Loriol, C., Dupuy, F., Rampal, R.,
- Page 14 and 15: Abréviations _____________________
- Page 17: Résumé La O-fucosylation est l’
- Page 21: Sommaire AVANT-PROPOS .............
- Page 26 and 27: Figure 26 : Expression des gènes i
- Page 29: Index des tableaux Tableau 1 : Cons
- Page 32 and 33: Avant-Propos ______________________
- Page 34 and 35: Avant-Propos ______________________
- Page 37: Ce manuscrit s'articule autour de t
- Page 41: 1 Une modification post-traductionn
- Page 45 and 46: Exposé bibliographique : La N-glyc
- Page 47 and 48: Exposé bibliographique : La N-glyc
- Page 49 and 50: Exposé bibliographique : La N-glyc
- Page 51 and 52: Exposé bibliographique : La N-glyc
- Page 53 and 54: Exposé bibliographique : La N-glyc
- Page 55 and 56: Exposé bibliographique : La N-glyc
- Page 57 and 58: Exposé bibliographique : La O-glyc
- Page 59 and 60: Exposé bibliographique : La O-glyc
- Page 61 and 62: Exposé bibliographique : La O-glyc
- Page 63 and 64: Exposé bibliographique : La O-glyc
- Page 65 and 66: Exposé bibliographique : La O-glyc
- Page 67 and 68: Exposé bibliographique : La O-glyc
- Page 69: De par leur localisation, souvent m
2.1.3 Rôles <strong>du</strong> O-fucose <strong>des</strong> domaines EGF .......................................................................................... 55<br />
2.2 DECOUVERTE RECENTE D’UNE ENZYME HOMOLOGUE A POFUT1, LA O-FUCOSYLTRANSFERASE 2 ..... 63<br />
2.2.1 Une seconde cible de la O-fucosylation, les TSR .......................................................................... 63<br />
2.2.1.1 Protéines possédant <strong>des</strong> TSR O-fucosylés........................................................................... 63<br />
2.2.1.2 Formation <strong>du</strong> O-fucosylglycane porté par les TSR ............................................................. 64<br />
2.2.2 Caractérisation de l’enzyme Pofut2 ..............................................................................................65<br />
2.2.2.1 Identification de l’activité O-fucosyltransférase 2............................................................... 65<br />
2.2.2.2 Etablissement de la structure <strong>du</strong> gène Pofut2 ...................................................................... 66<br />
2.2.2.3 Localisation sub-cellulaire de l’enzyme Pofut2................................................................... 68<br />
2.2.3 Rôles <strong>du</strong> O-fucose <strong>des</strong> domaines TSR ........................................................................................... 68<br />
2.3 CARACTERISTIQUES MOLECULAIRES ET FONCTIONNELLES DES O-FUCOSYLTRANSFERASES............... 71<br />
2.4 EXISTE T’IL UNE TROISIEME O-FUCOSYLTRANSFERASE ?.................................................................... 75<br />
2.5 O-FUCOSYLATION ET DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE.................................................................... 77<br />
POURQUOI GLYCOSYLATION ET MYOGENESE ? ................................................................................ 81<br />
3 LA MYOGENESE DU MUSCLE SQUELETTIQUE ........................................................................... 89<br />
3.1 ORIGINE EMBRYONNAIRE DU MUSCLE SQUELETTIQUE........................................................................ 93<br />
3.2 DETERMINATION MYOGENIQUE .......................................................................................................... 97<br />
3.2.1 Détermination <strong>et</strong> migration <strong>des</strong> prémyoblastes............................................................................. 97<br />
3.2.2 Différenciation <strong>des</strong> précurseurs musculaires................................................................................ 99<br />
3.2.2.1 Les protéines à domaine bHLH ........................................................................................... 99<br />
3.2.2.1.1 Facteurs myogéniques (MRFs) ....................................................................................... 99<br />
3.2.2.1.2 Cinétiques d'expression................................................................................................. 100<br />
3.2.2.1.3 Activités........................................................................................................................ 101<br />
3.2.2.2 Les protéines à domaine MADS........................................................................................ 104<br />
3.2.2.2.1 Facteur de réponse au sérum (SRF) .............................................................................. 104<br />
3.2.2.2.2 Famille <strong>des</strong> Myocyte Enhancer Factors 2 (MEF2) ....................................................... 105<br />
3.3 EFFECTEURS DE LA MYOGENESE....................................................................................................... 107<br />
3.3.1 Les in<strong>du</strong>cteurs ............................................................................................................................. 107<br />
3.3.1.1 La famille <strong>des</strong> Insulin-like growth factors (IGFs) ............................................................. 107<br />
3.3.1.2 La famille Wingless (WNTs)............................................................................................. 108<br />
3.3.2 Les inhibiteurs............................................................................................................................. 109<br />
3.3.2.1 La famille <strong>des</strong> Transforming growth factors β (TGFβ) ..................................................... 109<br />
3.3.2.2 La famille <strong>des</strong> Fibroblast growth factors (FGFs)............................................................... 110<br />
3.3.2.3 Notch <strong>et</strong> ses ligands ........................................................................................................... 111<br />
3.4 LA MYOGENESE IN VITRO .................................................................................................................. 115<br />
RESULTATS-DISCUSSION .............................................................................................. 117<br />
1 EVOLUTION DES GENES DE O-FUCOSYLTRANSFERASES. STRUCTURE ET EXPRESSION<br />
DES GENES POFUT1 ET POFUT2 CHEZ BOS TAURUS.......................................................................... 121<br />
1.1 PUBLICATION 1................................................................................................................................. 125<br />
1.2 RESULTATS COMPLEMENTAIRES....................................................................................................... 129<br />
1.2.1 Expression tissulaire <strong>des</strong> variants transcriptionnels................................................................... 129
Change language