caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...
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caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

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Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 2 __________________________________________________________________________________________ Figure 53 : Expression de Pofut1 dans des tissus de Mammifères. L’analyse a porté sur 50µg d’extrait protéique total d’un tissu et sur 100ng de protéine purifiée. Une protéine qui correspondrait à Pofut1, est reconnue par l’anticorps dans l’extrait protéique de cœur murin. Sa masse est similaire à celle de Pofut1A détectée dans un extrait de cœur bovin. Les extraits de muscles squelettiques de souris et de porc présentent une forme protéique de taille comparable à celle détectée dans les muscles squelettiques bovins adultes. Ainsi, les muscles squelettiques de ces deux autres espèces n’exprimeraient pas non plus la forme active de l’enzyme. Cette analyse confirme donc la présence chez d’autres espèces de Mammifères d’une forme tronquée de la protéine Pofut1. Il existerait donc un mécanisme conservé d’inactivation de la protéine Pofut1 dans les muscles squelettiques de Mammifères adultes. La caractérisation de cette forme protéique revêt donc un intérêt crucial, d’une part pour mieux comprendre la fonction biologique de la forme active, et d’autre part pour mettre en évidence si cette forme tronquée possède elle-même une fonction biologique indépendante de l’activité O-fucosyltransférase. 2.2.2 Expression tissulaire de l’enzyme bovine Pofut2 Cette étude a été conduite en parallèle avec celle portant sur l’expression de Pofut1. En effet, grâce aux anticorps polyclonaux anti-Pofut2, nous avons étudié l’expression tissulaire de la protéine bovine Pofut2, au sein des treize tissus adultes et des huit tissus embryonnaires bovins cités plus haut (Fig.54.). 178

Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 2 __________________________________________________________________________________________ Figure 54 : Profil d’expression tissulaire de la protéine bovine Pofut2. Treize tissus adultes et huit tissus embryonnaires ont été analysés. 50µg d’extraits protéiques tissulaires sont déposés par piste. 100 ng de la protéine Pofut2 bovine exprimée dans E. coli et purifiée servent de témoin. Les tailles des protéines révélées sont indiquées par des flèches sur la droite de la figure. Comme l’illustre la figure 54, le profil d’expression de Pofut2 dans les divers tissus analysés est plus complexe et encore plus inattendu que celui de Pofut1. La protéine Pofut2 qui a servi d’antigène pour la production des anticorps correspond à la forme Pofut2B et porte encore le peptide signal et une étiquette (His)6 à chacune de ses extrémités. Sa masse moléculaire déduite de la séquence peptidique est de 52 KDa. Dans tous les tissus, sauf les muscles squelettiques chez l’adulte, une protéine d’environ 50 KDa est détectée. Celle-ci pourrait correspondre à une forme triglycosylée de l’enzyme active Pofut2A ou diglycosylée de l’enzyme Pofut2B. Cependant, cette dernière hypothèse semble peu problable étant donné l’activité non significative de la forme Pofut2B in vitro (cf. Résultats complémentaire publication 1). Dans le cerveau embryonnaire, une forme protéique supplémentaire est détectée à une taille légèrement supérieure (~52 KDa); elle pourrait correspondre à la forme triglycosylée de Pofut2B. Dans le pancréas adulte, il existe deux formes supplémentaires de 45 et 37 KDa. Celles-ci ne peuvent pas correspondre aux produits des variants transcriptionnels Pofut2c, d ou e, dont la traduction conduirait à la même protéine non glycosylée de 18 KDa. Ces formes protéiques peuvent donc résulter de la traduction d’un autre variant transcriptionnel, qui serait spécifique de ce tissu. D’autres protéines de très haut poids moléculaires sont détectées dans le foie, les poumons et les reins adultes (~150 KDa) et dans le cerveau et tous les muscles squelettiques adultes (~100 KDa). Ces protéines sont d’ailleurs les seules à être reconnues par l’anticorps dans les muscles squelettiques chez 179

Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 2<br />

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Figure 54 : Profil d’expression tissulaire de la protéine bovine Pofut2.<br />

Treize tissus a<strong>du</strong>ltes <strong>et</strong> huit tissus embryonnaires ont été analysés. 50µg d’extraits protéiques tissulaires sont<br />

déposés par piste. 100 ng de la protéine Pofut2 bovine exprimée dans E. coli <strong>et</strong> purifiée servent de témoin. Les<br />

tailles <strong>des</strong> protéines révélées sont indiquées par <strong>des</strong> flèches sur la droite de la figure.<br />

Comme l’illustre la figure 54, le profil d’expression de Pofut2 dans les divers tissus<br />

analysés est plus complexe <strong>et</strong> encore plus inatten<strong>du</strong> que celui de Pofut1. La protéine Pofut2<br />

qui a servi d’antigène pour la pro<strong>du</strong>ction <strong>des</strong> anticorps correspond à la forme Pofut2B <strong>et</strong> porte<br />

encore le peptide signal <strong>et</strong> une étiqu<strong>et</strong>te (His)6 à chacune de ses extrémités. Sa masse<br />

moléculaire dé<strong>du</strong>ite de la séquence peptidique est de 52 KDa. Dans tous les tissus, sauf les<br />

muscles squel<strong>et</strong>tiques chez l’a<strong>du</strong>lte, une protéine d’environ 50 KDa est détectée. Celle-ci<br />

pourrait correspondre à une forme triglycosylée de l’enzyme active Pofut2A ou diglycosylée<br />

de l’enzyme Pofut2B. Cependant, c<strong>et</strong>te dernière hypothèse semble peu problable étant donné<br />

l’activité non significative de la forme Pofut2B in vitro (cf. Résultats complémentaire<br />

publication 1). Dans le cerveau embryonnaire, une forme protéique supplémentaire est<br />

détectée à une taille légèrement supérieure (~52 KDa); elle pourrait correspondre à la forme<br />

triglycosylée de Pofut2B. Dans le pancréas a<strong>du</strong>lte, il existe deux formes supplémentaires de<br />

45 <strong>et</strong> 37 KDa. Celles-ci ne peuvent pas correspondre aux pro<strong>du</strong>its <strong>des</strong> variants<br />

transcriptionnels Pofut2c, d ou e, dont la tra<strong>du</strong>ction con<strong>du</strong>irait à la même protéine non<br />

glycosylée de 18 KDa. Ces formes protéiques peuvent donc résulter de la tra<strong>du</strong>ction d’un<br />

autre variant transcriptionnel, qui serait spécifique de ce tissu. D’autres protéines de très haut<br />

poids moléculaires sont détectées dans le foie, les poumons <strong>et</strong> les reins a<strong>du</strong>ltes (~150 KDa) <strong>et</strong><br />

dans le cerveau <strong>et</strong> tous les muscles squel<strong>et</strong>tiques a<strong>du</strong>ltes (~100 KDa). Ces protéines sont<br />

d’ailleurs les seules à être reconnues par l’anticorps dans les muscles squel<strong>et</strong>tiques chez<br />

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