caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 1
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domaines EGF et TSR (Templeton et al., 2004), dont certains sont potentiellement Ofucosylables
(Tableau 4). Cette constatation nous a amené à penser que la seule enzyme de Ofucosylation
présente chez cette espèce, à savoir Pofut2, pouvait potentiellement avoir la
fonction de fucosyler les deux types de domaines. Chez cette espèce, le gène Pofut2 étant
monoexonique, nous avons pu amplifier le CDS par PCR en utilisant de l’ADN génomique
comme matrice (gracieusement fourni par Guan Zhu et Jan Keithly, Division of Infectious
Diseases, Wadsworth Center, New York State Department of Health, Albany, New York,
USA) et des amorces spécifiques choisies de part et d’autre de la séquence codante.
L’amplification ainsi obtenue a ensuite été clonée dans le vecteur d’expression eucaryote
pcDNA/TOPO3.1. L’expression hétérologue en cellules COS-1 de l’enzyme correspondante a
permis de réaliser in vitro des tests fonctionnels qui n’ont révélé aucune activité Ofucosyltransférase
sur les domaines TSR et EGF, utilisés pour la caractérisation des enzymes
Pofut bovines. Cependant, des analyses par western blot n’ont pu mettre en évidence la
présence de la protéine hétérologue, d’une masse estimée à 50 KDa (non glycosylée et sans le
peptide signal), dans les extraits protéiques des cellules COS-1 transfectées. Malgré tout, nous
pensons que l’enzyme Pofut2 de C. parvum a bien été exprimée, mais elle est tout simplement
trop divergente dans sa séquence en acides aminés pour être reconnue par notre anticorps anti-
Pofut2 bovin et pour fucosyler des motifs EGF ou TSR humains.
Tableau 4 : Séquences de domaines EGF et TSR O-fucosylables présents dans des protéines
(non caractérisées) de Cryptosporidium parvum.
Les cystéines conservées participant à la formation des ponts disulfures sont en gras; le site potentiel de Ofucosylation
est en gras, rouge et souligné.
Protéines
Cgd3_1860 EAK89110
Cgd2_1590 EAK88814
Cgd1_3500 EAK88310
Cgd6_780 EAK90179
N° d’accès Type Séquences
EGF
n°1 sur 9
EGF
n°5 sur 5
TSR
n°3 sur 6
TSR
n°1 sur 3
C 1 LMPNYC 2 SKEATC 3 KSDIVGQQTYIDYLNA
LPRC 4 QC 5 LPGYIGDGRTKGTGC 6 Q
C 1 EENNPC 2 DLSISSC 3 INTPGSYIC 4 DC 5 FKS
AGYMTSPINNKIC 6 I
VGSWSEWSDC 1 STSC 2 GEGNRIRTREITKPPL
NGDDSKC 3 PELIEKESC 4 NKDC 5 PHVQC 6
YSQWSSWLPC 1 TSTC 2 NGGTTYRWRYPLNEVM
AGGLEC 3 TITSQISAC 4 NSDVEC 5 LPC 6
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