caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...
caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ... caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...
Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 1 __________________________________________________________________________________________ Pofut2A MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60 Pofut2B MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60 Pofut2C MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60 Pofut2D MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60 Pofut2E MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60 Pofut2A DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120 Pofut2B DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120 Pofut2C DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120 Pofut2D DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120 Pofut2E DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120 Pofut2A EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRGWFW 180 Pofut2B EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRGWFW 180 Pofut2C EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRDRPP 180 Pofut2D EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRDRPP 180 Pofut2E EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRDRPP 180 Pofut2A GYEETRGLNV SCLSVQGSAS IIAPVLLRNT SARSVMLDRA ENLLHDHYGG KEYWDTRRSM 240 Pofut2B GYEETRGLNV SCLSVQGSAS IIAPVLLRNT SARSVMLDRA ENLLHDHYGG KEYWDTRRSM 240 Pofut2C SSRLYY---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 186 Pofut2D SSRLYY---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 186 Pofut2E SSRLYY---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 186 Pofut2A VFARHLRAVG DEFRSRYLNS TDVADGIPFE EDWTQMKVKL GSSLGGPYLG VHLRRKDFIW 300 Pofut2B VFARHLRAVG DEFRSRYLNS TDVADGIPFE EDWTQMKVKL GSSLGGPYLG VHLRRKDFIW 300 Pofut2C ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2D ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2E ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2A GHREDVPSLD GAVRKIRSLM KAHQLDKVFV ATDAVRK--- ---------- ---------- 337 Pofut2B GHREDVPSLD GAVRKIRSLM KAHQLDKVFV ATDAVRKELW VCACLCETPL GCASPPRCPL 360 Pofut2C ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2D ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2E ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2A -------ELE ELRRLLPEMV RFEPTWEELE LYKDGGVAIV DQWICAHARF FIGTSVSTFS 390 Pofut2B TSPLAPTELE ELRRLLPEMV RFEPTWEELE LYKDGGVAIV DQWICAHARF FIGTSVSTFS 420 Pofut2C ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2D ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2E ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Pofut2A FRIHEEREIL GLDPKTTYNR FCGDKEKACE QPTHWRIAY 429 Pofut2B FRIHEEREIL GLDPKTTYNR FCGDKEKACE QPTHWRIAY 459 Pofut2C ---------- ---------- ---------- --------- Pofut2D ---------- ---------- ---------- --------- Pofut2E ---------- ---------- ---------- --------- Figure 46 : Alignement des séquences protéiques déduites des cinq variants transcriptionnels du gène bovin Pofut2. Le peptide signal est en rose, les sites potentiels de N-glycosylation en jaune, les trois motifs conservés avec les α2- et α6-fucosyltransférases sont : en bleu (motif I), en gris (motif II) et en vert (motif III). Le motif DXD est en gras souligné. Dans la protéine Pofut2B, l’insertion de 30aa dans le motif II est indiquée en gras. La position des acides aminés est indiquée sur la droite de l’alignement. Les acides aminés qui diffèrent de ceux de Pofut2A sont en rouge. 140
Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 1 __________________________________________________________________________________________ Dans le but de déterminer si les variants transcriptionnels sont susceptibles de coder des protéines dotées d’une activité O-fucosyltransférase, des tests d’activité in vitro ont été effectués. La séquence codante de chacun des variants transcriptionnels a été clonée dans le vecteur d’expression eucaryote pcDNA/TOPO3.1. Les plasmides recombinants ont ensuite étaient utilisés pour transfecter des cellules COS-1. Les tests d’activité sont réalisés avec 5µg de lysats cellulaires en utilisant comme substrat donneur le GDP-fucose radiomarqué au C 14 et comme substrats accepteurs, le domaine EGF du facteur de coagulation IX humain pour Pofut1 (Fig.47.) ou le troisième domaine TSR de la thrombospondine I humaine pour Pofut2 (Fig.48.). Figure 47 : Activité O-fucosyltransférase 1 des protéines codées par les variants bovins Pofut1a à Pofut1e. A, Les activités sont données en nmole par heure et par mg de protéines totales. Elles sont indiquées au dessus de chaque histogramme; B, Analyses en western blot de l’expression des protéines recombinantes dans les cellules COS-1 et détection à l’aide de l’anticorps anti-Pofut1. 100 µg de protéines totales ont été déposées; les tailles des protéines détectées sont indiquées. 141
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Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 1<br />
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Pofut2A MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60<br />
Pofut2B MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60<br />
Pofut2C MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60<br />
Pofut2D MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60<br />
Pofut2E MAALAVVFLL LWAASWPSAS AFGEEFWPGQ SAADILSGAA SRRRYLLYDV NPPEGFNLRR 60<br />
Pofut2A DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120<br />
Pofut2B DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120<br />
Pofut2C DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120<br />
Pofut2D DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120<br />
Pofut2E DVYIRIASLL KTLLKTEEWV LVLPPWGRLY HWQSPDIHQV RIPWSDFFDL PSLNRNIPVI 120<br />
Pofut2A EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRGWFW 180<br />
Pofut2B EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRGWFW 180<br />
Pofut2C EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRDRPP 180<br />
Pofut2D EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRDRPP 180<br />
Pofut2E EYEQFIAESG GPFIDQVYIL QGYAEGWKEG AWEEKIDSRP CIEPPLYSQD KHEYYRDRPP 180<br />
Pofut2A GYEETRGLNV SCLSVQGSAS IIAPVLLRNT SARSVMLDRA ENLLHDHYGG KEYWDTRRSM 240<br />
Pofut2B GYEETRGLNV SCLSVQGSAS IIAPVLLRNT SARSVMLDRA ENLLHDHYGG KEYWDTRRSM 240<br />
Pofut2C SSRLYY---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 186<br />
Pofut2D SSRLYY---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 186<br />
Pofut2E SSRLYY---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 186<br />
Pofut2A VFARHLRAVG DEFRSRYLNS TDVADGIPFE EDWTQMKVKL GSSLGGPYLG VHLRRKDFIW 300<br />
Pofut2B VFARHLRAVG DEFRSRYLNS TDVADGIPFE EDWTQMKVKL GSSLGGPYLG VHLRRKDFIW 300<br />
Pofut2C ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2D ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2E ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2A GHREDVPSLD GAVRKIRSLM KAHQLDKVFV ATDAVRK--- ---------- ---------- 337<br />
Pofut2B GHREDVPSLD GAVRKIRSLM KAHQLDKVFV ATDAVRKELW VCACLCETPL GCASPPRCPL 360<br />
Pofut2C ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2D ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2E ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2A -------ELE ELRRLLPEMV RFEPTWEELE LYKDGGVAIV DQWICAHARF FIGTSVSTFS 390<br />
Pofut2B TSPLAPTELE ELRRLLPEMV RFEPTWEELE LYKDGGVAIV DQWICAHARF FIGTSVSTFS 420<br />
Pofut2C ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2D ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2E ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------<br />
Pofut2A FRIHEEREIL GLDPKTTYNR FCGDKEKACE QPTHWRIAY 429<br />
Pofut2B FRIHEEREIL GLDPKTTYNR FCGDKEKACE QPTHWRIAY 459<br />
Pofut2C ---------- ---------- ---------- ---------<br />
Pofut2D ---------- ---------- ---------- ---------<br />
Pofut2E ---------- ---------- ---------- ---------<br />
Figure 46 : Alignement <strong>des</strong> séquences protéiques dé<strong>du</strong>ites <strong>des</strong> cinq variants transcriptionnels <strong>du</strong><br />
gène bovin Pofut2.<br />
Le peptide signal est en rose, les sites potentiels de N-glycosylation en jaune, les trois motifs conservés avec les<br />
α2- <strong>et</strong> α6-fucosyltransférases sont : en bleu (motif I), en gris (motif II) <strong>et</strong> en vert (motif III). Le motif DXD est<br />
en gras souligné. Dans la protéine Pofut2B, l’insertion de 30aa dans le motif II est indiquée en gras. La position<br />
<strong>des</strong> aci<strong>des</strong> aminés est indiquée sur la droite de l’alignement. Les aci<strong>des</strong> aminés qui diffèrent de ceux de Pofut2A<br />
sont en rouge.<br />
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