caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 1
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Après purification de quantités avoisinant 1mg de protéines recombinantes, Pofut1 et
Pofut2 bovines ont été utilisées pour immuniser des lapins (2 individus pour chaque protéine),
en vue d’obtenir des anticorps polyclonaux. Le programme d’immunisation a été réalisé par
une société spécialisée (Agro-Bio, La Ferté St Aubin, France).
Pour tester la reconnaissance spécifique de ces anticorps, nous avons effectué des
analyses par western blot avec chaque serum reçu, d’une part sur les protéines ayant servi à
l’immunisation des lapins, et d’autre part sur des lysats de cellules COS-1 transfectées avec le
vecteur d’expression eucaryote pcDNA/TOPO3.1 contenant les inserts Pofut1a ou Pofut2a ou
Pofut2b. Comme c’est le variant Pofut2a qui code potentiellement la forme active de
l’enzyme, il est impératif de l’inclure dans nos tests. La figure 43 présente les résultats
obtenus pour chaque protéine avec le dernier sérum d’un des deux lapins immunisés. Le
contrôle par western blot des sérums pré-immuns des lapins est négatif (résultats non
présentés).
Figure 43 : Vérification de la spécificité des anticorps dirigés contre les enzymes bovines Pofut1
et Pofut2.
Pistes 1 et 6, 50µg de protéines de cellules COS-1 non transfectées; piste 2, 50µg de protéines de cellules COS-1
transfectées avec le vecteur pcDNA/TOPO3.1-Pofut1a; piste 3, 100ng de protéine Pofut1A exprimée dans E.
coli et purifiée; piste 4, 50µg de protéines de cellules COS-1 transfectées avec le vecteur pcDNA/TOPO3.1-
Pofut2a; piste 5, 50µg de protéines de cellules COS-1 transfectées avec le vecteur pcDNA/TOPO3.1-Pofut2b;
piste 7, 100ng de protéine Pofut2B exprimée dans E. coli et purifiée.
Les protéines produites dans les cellules COS-1 (Fig.44.) sont reconnues par les
anticorps correspondants. Ces enzymes potentiellement glycosylées (comme nous l’avons vu
dans le chapitre 1) et dépourvues de leur peptide signal (masse d’environ 3 KDa) migrent au
même niveau que la protéine produite en système bactérien, qui conserve le peptide signal, est
dépourvue de glycosylation et possède deux étiquettes histidine.
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