caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 1
__________________________________________________________________________________________
L’expression de chaque protéine est induite pendant 4 heures à 37°C par l’addition
d’IPTG à une concentration de 1mM. L’analyse, par électrophorèse en gel d’acrylamide à
10,5% en conditions dénaturantes, des fractions protéiques totales avant (Fig.41., pistes 1) et
après induction (Fig.41., Pistes 2) permet de mettre en évidence l’expression des deux
enzymes. Celles-ci sont ensuite purifiées (Fig.41., Pistes 3) sur résine de Nickel grâce à la
présence de six résidus histidine à chacune de leurs extrémités (Fig.42.). Les tailles attendues
pour les protéines taggées et non glycosylées, car exprimées dans la bactérie, sont pour
Pofut1A de 46,9 KDa et pour Pofut2B de 52 KDa.
Figure 41 : Analyse par SDS-PAGE 10,5% de l’expression des enzymes recombinantes bovines
Pofut1A et Pofut2B.
Pistes 1, protéines bactériennes avant induction; pistes 2, protéines bactériennes après induction; pistes 3, 1µg
des fractions protéiques purifiées.
La présence de deux étiquettes histidine, à la fois en N et C-terminal, sur chaque
protéine permet d’augmenter le rendement des étapes de purification sur résine de nickel
(Ni 2+ ).
Figure 42 : Représentation schématique des protéines Pofut1A et Pofut2B bovines produites
dans le système bactérien.
Le peptide signal est en rose, les motifs conservés entre les α2-, α6- et les O-fucosyltransférases en orange, le
DXD en violet, le KDEL-like de Pofut1 en vert. Les acides aminés, au nombre de 51, rajoutés par le vecteur sont
en jaune et les étiquettes histidine sont en bleu foncé.
135