caractérisation des enzymes bovines et étude préliminaire du rôle ...

Résultats-Discussion : Résultats complémentaires de la publication 1
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1.2.2 Production d’anticorps anti-Pofut bovins
Avant de déterminer les activités des O-fucosyltransférases bovines codées par les
différents variants, et dans le but d’étudier l’expression de celles-ci dans différents tissus
bovins ou autres, nous avons produit des anticorps spécifiquement dirigés contre ces enzymes.
Les séquences codantes des transcrits Pofut1a et Pofut2b (uniques variants dont nous
disposions à l’époque) ont été clonées de manière orientée dans le vecteur d’expression
bactérien pET28c, grâce aux sites de restriction NdeI et XhoI. Le clonage des séquences
bovines a nécessité, au préalable, leur amplification avec des couples d’amorces apportant les
sites de restriction enzymatique et permettant de conserver le cadre de lecture avec le vecteur
pET28c qui apporte le codon d’initiation de la traduction. Les couples d’amorces utilisés sont
répertoriés dans le tableau 3.
Tableau 3 : Couples d’amorces utilisés pour les clonages en vecteur d’expression procaryote
pET28c.Les sites de restrictions sont soulignés.
Amorces Séquences
Pofut1-NdeI/5’ 5’-CATATGGGCGCCGCCGCG-3’
Pofut1-XhoI/3’ 5’-CTCGAGGAATTCATCCCGCAGCTG-3’
Pofut2-NdeI/5’ 5’-CATATGGCGGCGCTTGCCGTCGTC-3’
Pofut2-XhoI/3’ 5’-CTCGAGGTATGCAATCCTCCAATG-3’
Les amplifiats ainsi obtenus sont d’abord clonés dans le plasmide TOPO2.1. Puis, les
séquences d’intérêt sont isolées grâce à la double digestion du plasmide par les enzymes de
restriction NdeI et XhoI. Elles sont ensuite introduites aux mêmes sites dans le vecteur
pET28c, préalablement digéré. Ce vecteur porte le promoteur du bactériophage T7 et
l’opérateur lacUV5 pour le contrôle de l’expression du gène d’intérêt. Les constructions,
pET28c-Pofut1a et pET28c-Pofut2b, sont transformées dans la souche Escherichia coli
BL21(DE3) qui porte dans son génome le gène codant l’ARN polymérase T7 (lysogène
λDE3) sous la dépendance du promoteur lacUV5, inductible par un galactoside. En présence
de l’inducteur, un βgalactoside, le gène de l’ARN polymérase présent sur le chromosome
bactérien s’exprime. L’absence de répression permet à cette polymérase d’initier la
transcription du gène d’intérêt.
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