Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 3 : Interactions des nanoparticules avec les cellules
3.1 Etude de l’exposition à temps courts (24 h)
Les fibroblastes dermiques humains ont été mis en culture 2D dans du milieu de culture
complet (DMEM, complémenté par 10% de SVF, une solution de pénicilline/ streptomycine
et 1% d’une solution d’antifungique) dans des plaques 24 puits et incubés 24 heures pour
adhérer au support avant d’être exposés à une suspension de nanoparticules de silice dans du
milieu de culture complet (cf chapitre 6 p. 190). Pour pouvoir comparer l’influence de
particules de tailles différentes, il est important de fixer un paramètre de concentration :
massique, molaire ou surfacique. Notre choix s’est porté sur une concentration massique,
facteur utilisé couramment dans les études biologiques. Par ailleurs, la valeur de 0,6 mg/mL a
été fixée compte tenu des impératifs techniques dus aux modes de suivi, DLS et fluorescence,
qui nécessitent une intensité suffisante pour obtenir des résultats valides. Le détail des
expériences est donné dans le chapitre présentant les protocoles expérimentaux.
3.1.1 INTERNALISATION DES NANOPARTICULES
A différents temps au cours des premières 24 heures, les cellules ont été fixées pour être
observées en microscopie à fluorescence et en microscopie électronique en transmission.
En 24 heures, on observe l’internalisation des nanoparticules dans les NHDF, quelles que
soient les caractéristiques des particules utilisées (taille, charge de surface). Cependant la
taille des particules a une influence sur la cinétique d’internalisation ainsi que sur les
conséquences de cette internalisation. Deux marqueurs fluorescents sont utilisés afin de
visualiser les membranes cellulaires et les vésicules acides. Les résidus N-acétylglucosamine
de la membrane plasmique fixent le marqueur WGA (Wheat Germ Agglutinin) contenant un
fluorophore (AlexaFluor 555) qui émet dans le rouge. Compte-tenu des longueurs d’ondes
d’émission des particules (FITC) et du marqueur membranaire, le marqueur des vésicules
acides ou lysosomes a été choisi pour émettre dans une zone différente et coïncidant avec les
filtres à disposition sur le microscope à fluorescence. Le choix s’est porté sur le marqueur
Lysosensor Yellow-Blue, qui apparaît en bleu foncé dans des vésicules légèrement acides et
en jaune dans des vésicules très acides comme les lysosomes.
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