Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
dans l’éthanol est ajoutée (5% en volume). Après 48 heures sous agitation à l’abri de la
lumière, les particules sont dialysées.
6.4.4.2 Suivi de la liberation du marqueur Hoechst
La libération du marqueur Hoechst 33258 est suivie par microscopie à fluorescence sur les
cellules fixées 1 heure avec du PFA 4% à 4°C. Pour mettre en évidence le marquage du noyau
par Hoechst 33258, ce dernier est marqué avec de l’iodure de propidium selon le protocole
décrit ci-après.
Marquage du noyau à l’iodure de propidium :
Avant de marquer le noyau, il faut perméabiliser la membrane en incubant les cellules 10
minutes avec une solution de PBS 1X contenant 1% de BSA et 0,5%o de Triton X-100.
Ensuite, après avoir été rincées avec du tampon SSC 2X (0,3 M NaCl, 0,03 M citrate de
sodium, pH 7,0) les cellules sont traitées avec de la RNase 100 µg/mL pendant 20 minutes à
37°C. Les cellules sont alors rincées trois fois 2 minutes dans le tampon SSC 2X puis
marquées avec une solution d’iodure de propidium (10 minutes avec une solution à 500 nM).
Après rinçage, les lames sont montées avec le réactif Slowfade ® Gold Antifade pour être
observées.
209