Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Figure 6-7: Principe du test MTT
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Protocole opératoire : A différents temps après l’ajout des cellules en surface, les gels sont
incubés 4 heures avec 500 µL d’une solution de MTT (5 mg/mL dans PBS 1X). Au terme de
cette incubation, les gels sont rincés 3 fois avec de l’eau distillée (ou jusqu’à obtenir une
solution de rinçage incolore) avant d’ajouter le DMSO. Après 30 minutes sous agitation, la
DO est mesurée à 570 nm.
6.4 Etude des nanoparticules incorporant les ponts disulfures
6.4.1 INFLUENCE DU PH SUR LA DISSOLUTION
Pour évaluer l’influence du pH sur la dissolution, les particules sont mises en suspension dans
un tampon acétate (50 mM, 10 mM KCl) à pH 4,5 (pH trouvé dans les lysosomes) et leur
dissolution est suivie par dosage de la silice dissoute avec le molybdate d’ammonium
(§6.2.1.2).
6.4.2 COMPORTEMENT EN PRESENCE DE REDUCTEURS : REACTION AVEC LE
DTT
Dans le cas des particules n%SS, la réduction des ponts disulfures par du DTT a été étudiée.
Cette étude se fait sous atmosphère inerte (N2) afin d’empêcher l’oxydation du DTT avec le
dioxygène de l’air. Le DTT réagit avec les ponts disulfures selon l’équation décrite dans le
schéma 6.9 et forme un composé cyclique dont le maximum d’absorption se situe autour de
290 nm. Les particules n%SS sont mises en suspension à 0,6 mg/mL dans 30 mL de tampon
Tris-HCl pH 7,4, le dioxygène dissous est éliminé en faisant buller de l’azote pendant 5
minutes. Après ajout de 200 µL d’une solution de DTT (62 mg de DTT dans 2 mL de tampon
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