Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Lorsque le gel est entièrement hydrolysé, l’ensemble est centrifugé pendant 5 minutes à 1000
rpm et les cellules sont resuspendues dans 200 µL de PBS 1X. Ces cellules sont ensuite
colorées avec du bleu de Trypan (40 µL d’une solution à 0,4% dans du PBS 1X) et comptées
à l’aide d’un hémacytomètre.
L’activité métabolique est évaluée avec le test à la résazurine comme décrit pour les cellules
(§6.2.3.2 (ii)).
6.3.4 ETUDE DE GELS COMPOSITES
6.3.4.1 Suivi de l’adhésion par marquage au DAPI
Afin d’étudier l’adhésion des fibroblastes sur les matrices de collagène, ces dernières sont
fixées 30 min, 3 h, 6h, 9h, 12h et 24h après l’ajout des cellules en surface des gels. Les
matrices sont rincées trois fois avec du PBS 1X avant d’être fixées avec du paraformaldehyde
à 4% dans du PBS pendant 1 heure. Les échantillons sont de nouveau rincés avant le
marquage des noyaux au DAPI, comme décrit précédemment (§ 6.2.3.1 (i)). Une fois
marquées, les cellules sont comptées à l’aide d’un microscope à fluorescence en dénombrant
le nombre de noyaux sur 7 zones réparties sur l’ensemble de la matrice. Chaque zone
représente 0,56 mm 2 (grandissement x10). L’analyse statistique permet d’obtenir la densité
cellulaire moyenne ainsi que sa distribution.
6.3.4.2 Suivi de la proliferation par MTT
La succinate déshydrogénase mitochondriale réduit le cycle tétrazolium du MTT (de couleur
jaune) pour former des cristaux de formazan de couleur violette (figure 6.7). Ces cristaux sont
dissous avec du DMSO et la densité optique à 570 nm est mesurée. Cette DO est
proportionnelle au nombre de cellules vivantes et peut y être reliée à l’aide d’une courbe
étalon.
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