Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Par ailleurs, des gels à 5 mg/mL ont été formés par neutralisation avec un tampon Tris-HCl
1M. Ces gels sont obtenus en mélangeant 3,75 mL de collagène à 10 mg/mL avec 2,47 mL
d’eau Milli-Q, 470 µL de la source de silice à 0,5 M (nanoparticules dans l’acide acétique 17
mM ou silicate neutralisé avec HCl 3 M) et 810 µL de Tris-HCl 1M.
6.3.2 SUIVI DE LA DIFFUSION ET DISSOLUTION
6.3.2.1 Dispositif de diffusion et suivi par fluorescence
24 heures après la formation du gel de collagène dans l’insert, le milieu au-dessus du gel est
remplacé par une suspension de nanoparticules de silice fluorescentes dans du milieu de
culture complet. Toutes les études sont faites à une concentration massique de 0,6 mg/mL en
nanoparticules dans du milieu de culture sans rouge phénol. Chaque condition est réalisée au
minimum en triplicat. 400 µL du milieu situé sous la membrane sont prélevés à des temps
prédéfinis (de 30 minutes à 72 heures) afin de mesurer l’intensité de fluorescence, et
remplacés par 400 µL de milieu. Il est tenu compte de cette dilution dans les courbes
d’évolution de l’intensité présentées : I(t)réelle = I(t)mesurée + 0,4*I(t-1)réelle. A chaque temps, le
prélèvement est divisé en deux : une moitié est centrifugée dans un filtre Nanosep 3 kD (15
minutes, 10000 tours/minutes) afin de retirer les nanoparticules de la suspension, l’autre
moitié est analysée directement. L’intensité de fluorescence de tous les prélèvements est
mesurée à 530 nm avec une excitation à 485 nm. L’intensité de fluorescence du centrifugat
correspond à la fluorescéine dissoute tandis que l’intensité de fluorescence liée aux
nanoparticules est obtenue par différence entre l’intensité du prélèvement total et celle du
centrifugat. Les courbes finales sont tracées comme pourcentage de l’intensité de la
suspension de nanoparticules à 0,6 mg/mL pour l’évolution des particules et en pourcentage
de l’intensité de la suspension entièrement dissoute pour la fluorescéine. L’influence de
différents paramètres sur la diffusion a été étudiée : (i) la taille des nanoparticules, (ii) la
charge de surface des nanoparticules, (iii) la présence de cellules et (iv) la concentration en
collagène. Le schéma 6.9 décrit le principe de suivi de la diffusion par spectroscopie de
fluorescence.
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