Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
lentement sous air et permet de suivre l’évolution de la concentration de collagène par pesée.
Cependant il faut rester conscient que cette méthode va provoquer une augmentation de la
concentration en acide acétique (et donc du pH) puisque l’eau va s’évaporer plus rapidement
que l’acide acétique.
6.3.1.4 Formation des gels de collagène
Il faut distinguer deux protocoles légèrement différents selon que l’on veut obtenir des gels de
collagène à 3 mg/mL (H3) et 5 mg/mL (H5) ou des gels à 1,5 mg/mL (H1.5). La modification
de protocole concerne la température de travail de la première étape et est due à la différence
de viscosité des solutions de collagène utilisées : pour H3 et H5 on part d’une solution de
collagène à 10 mg/mL très visqueuse qu’il faut manipuler à température ambiante, tandis que
pour H1.5 la solution de départ est à 5 mg/mL et peut être manipulée à 4°C. Le première
étape consiste à mélanger le collagène et le milieu de culture à 4°C pour H1,5 et à 20°C pour
H3 et H5 puis de refroidir à 4°C. Ensuite ce mélange est neutralisé par l’ajout d’une solution
de soude stérile à 0,1 mol/L. Enfin une suspension de cellules à 500,000 cellules par millilitre
est ajoutée. Rapidement (avant gélification) le gel est coulé (figure 6.5). Une fois gélifié, on
recouvre le gel de milieu de culture pour éviter qu’il ne se dessèche et on le place dans
l’incubateur (atmosphère humide, 5% CO 2). Le gel n’est utilisé que 24 heures après sa
formation afin de laisser le temps aux cellules d’adhérer à leur nouvel environnement.
Pour l’étude de la diffusion, 300 µL de gels sont coulés dans des inserts de culture avec une
membrane poreuse (pores de 2,0 µm). Ces gels sont recouverts avec 500 µL de milieu et
l’insert est placé dans une plaque 24 puits contenant 1 mL de milieu
Le schéma 6.8 récapitule le procédé d’obtention des gels H3 et H3c. Le tableau 6.3 regroupe
les proportions utilisées pour obtenir les différents gels.
Formation de gels composites
Des gels encapsulant des nanoparticules de silice de façon isotrope ont été synthétisés, ainsi
que des gels hybrides incorporant une solution neutralisée de silicate. Le protocole est le
même que pour les gels précédents en ajoutant une étape avant la neutralisation qui consiste à
l’adjonction d’une suspension de nanoparticules dans l’acide acétique 17 mM ou de la
solution de silicate, neutralisée avec de l’acide chlorhydrique 3 M, à 0,5 mol/L.
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