Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Pour libérer les résidus hydroxyproline, une masse connue de collagène est hydrolysée dans
un excès d’HCl 6 N à 100°C pendant une nuit. L’échantillon est ensuite séché avant d’être
repris dans 1 mL d’eau Milli-Q. Différentes dilutions de l’échantillon seront ensuite dosées en
prélevant des aliquots de 10, 20 et 40 µL complétés à 400 µL avec de l’eau Milli-Q.
L’hydroxyproline est ensuite oxydée par ajout de 200 µL d’une solution de chloramine T à
température ambiante pendant 20 min. Cette réaction est stoppée par ajout d’acide
perchlorique 3,15 M (200 µL) pendant 5 minutes à température ambiante. Enfin, 200 µL de
dimethylamino-4-benzaldehyde sont ajoutés et la solution est maintenue à 60°C pendant 20
min. Le dimethylamino-4-benzaldehyde forme un complexe coloré avec l’hydroxyproline
oxydée, dont la concentration est déterminée par mesure de la densité optique à 557 nm. Cette
valeur est corrélée à la concentration en hydroxyproline via une gamme étalon
d’hydroxyproline commerciale. Ainsi la concentration en hydroxyproline dans les aliquots
est-elle obtenue et permet de remonter à la concentration massique en collagène en
multipliant par les différents facteurs de dilution et par 7,6 (car l’hydroxyproline représente
13% de la masse de collagène).
Solutions :
Tampon de dosage : acide citrique monohydraté 0,25 M (6,25 g), acétate de sodium trihydraté
1 M (17,5 g), hydroxyde de sodium 0,85 M (4,25 g), acide acétique glacial (1,5 mL), H20
Milli-Q (125 mL).
Acide perchlorique : acide perchlorique (27 mL pour 100 mL de volume total complété avec
de l’eau Milli-Q)
Hydroxyproline : Hydroxy-L-proline (20 mg/L dans l’eau)
Chloramine T : Chloramine T (400 mg), H20 (5 mL), Methyl Cellosolve (7,5 mL), Tampon
de dosage (12,5 mL)
Solution de DMBA : Diméthylamino-4-benzaldehyde (0,5 g), Methyl Cellosolve (2,5 mL), à
chauffer à 60°C pendant 30min pour une meilleure dissolution.
6.3.1.3 Obtention de solutions plus concentrées
Des solutions de collagène plus concentrées (10 – 15 mg/mL) sont obtenues simplement par
évaporation. Un volume connu d’une solution diluée de collagène de concentration connue est
mis à évaporer sous une hotte à flux laminaire en conditions stériles. L’évaporation est faite
199