Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
6.2.3.3 Dissolution intracellulaire et exocytose<br />
Afin <strong>de</strong> déterminer si les particules internalisées sont capables <strong>de</strong> ressortir <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules ou si<br />
elles sont dégradées <strong>de</strong> façon intracellulaire, après une semaine d’exposition à une susp<strong>en</strong>sion<br />
<strong>de</strong> particules dans le <strong>milieu</strong> <strong>de</strong> culture à 0,6 mg/mL, les cellules sont rincées et le <strong>milieu</strong><br />
changé. Tous les jours, le <strong>milieu</strong> est intégralem<strong>en</strong>t prélevé, et remplacé par du <strong>milieu</strong> neuf,<br />
pour mesurer l’int<strong>en</strong>sité <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce totale ainsi que celle <strong><strong>de</strong>s</strong> formes solubles, obt<strong>en</strong>ues<br />
par séparation <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>nanoparticules</strong> du reste du <strong>milieu</strong> (c<strong>en</strong>trifugation dans un tube avec un seuil<br />
<strong>de</strong> rét<strong>en</strong>tion <strong>de</strong> 3,5 kD p<strong>en</strong>dant 15 minutes à 10 000 rpm). L’int<strong>en</strong>sité <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce est<br />
mesurée au maximum d’émission, pour une excitation à 485 nm.<br />
6.3 Diffusion <strong><strong>de</strong>s</strong> particules dans <strong><strong>de</strong>s</strong> hydrogels <strong>de</strong> collagène<br />
6.3.1 FORMATION DES GELS DE COLLAGENE<br />
6.3.1.1 Extraction du collagène <strong>de</strong> type I<br />
(i) Obt<strong>en</strong>tion <strong><strong>de</strong>s</strong> t<strong>en</strong>dons<br />
L’extraction se fait à partir <strong>de</strong> t<strong>en</strong>dons <strong>de</strong> queue <strong>de</strong> rat, sous une hotte à flux laminaire stérile.<br />
Pour récupérer les t<strong>en</strong>dons, il faut serrer la queue à 1 cm <strong>de</strong> son extrémité fine et à l’ai<strong>de</strong><br />
d’une pince (type coupe-ongles) casser la vertèbre par rotation du poignet et tirer pour sortir<br />
le t<strong>en</strong>don. L’opération est répétée <strong>de</strong> cm <strong>en</strong> cm <strong>en</strong> remontant, <strong>en</strong> s’arrêtant à <strong>en</strong>viron 3 cm <strong>de</strong><br />
la base <strong>de</strong> la queue. Les t<strong>en</strong>dons ainsi prélevés sont plongés dans un bécher <strong>de</strong> PBS 1X.<br />
(ii) Lavage <strong><strong>de</strong>s</strong> t<strong>en</strong>dons prélevés<br />
Les t<strong>en</strong>dons doiv<strong>en</strong>t être lavés abondamm<strong>en</strong>t pour éliminer toutes les traces <strong>de</strong> sang. La<br />
première étape consiste à c<strong>en</strong>trifuger plusieurs fois les t<strong>en</strong>dons (4°C, 4400 tours/min, 5min)<br />
<strong>en</strong> les rinçant avec du PBS 1X. Lorsque le surnageant est limpi<strong>de</strong> et incolore, les t<strong>en</strong>dons sont<br />
plongés dans une solution <strong>de</strong> NaCl 4M pour induire l’éclatem<strong>en</strong>t cellulaire par choc<br />
osmotique et évacuer les év<strong>en</strong>tuelles traces <strong>de</strong> sang et d’albumine. Enfin, les t<strong>en</strong>dons sont à<br />
nouveau rincés dans du PBS 1X et c<strong>en</strong>trifugés plusieurs fois (4°C, 4400 tours/min, 5 min)<br />
pour élimer un maximum <strong>de</strong> sel et les débris cellulaires.<br />
197
Change language