Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
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tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
6.2.3.3 Dissolution intracellulaire et exocytose<br />
Afin <strong>de</strong> déterminer si les particules internalisées sont capables <strong>de</strong> ressortir <strong><strong>de</strong>s</strong> cellules ou si<br />
elles sont dégradées <strong>de</strong> façon intracellulaire, après une semaine d’exposition à une susp<strong>en</strong>sion<br />
<strong>de</strong> particules dans le <strong>milieu</strong> <strong>de</strong> culture à 0,6 mg/mL, les cellules sont rincées et le <strong>milieu</strong><br />
changé. Tous les jours, le <strong>milieu</strong> est intégralem<strong>en</strong>t prélevé, et remplacé par du <strong>milieu</strong> neuf,<br />
pour mesurer l’int<strong>en</strong>sité <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce totale ainsi que celle <strong><strong>de</strong>s</strong> formes solubles, obt<strong>en</strong>ues<br />
par séparation <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>nanoparticules</strong> du reste du <strong>milieu</strong> (c<strong>en</strong>trifugation dans un tube avec un seuil<br />
<strong>de</strong> rét<strong>en</strong>tion <strong>de</strong> 3,5 kD p<strong>en</strong>dant 15 minutes à 10 000 rpm). L’int<strong>en</strong>sité <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>ce est<br />
mesurée au maximum d’émission, pour une excitation à 485 nm.<br />
6.3 Diffusion <strong><strong>de</strong>s</strong> particules dans <strong><strong>de</strong>s</strong> hydrogels <strong>de</strong> collagène<br />
6.3.1 FORMATION DES GELS DE COLLAGENE<br />
6.3.1.1 Extraction du collagène <strong>de</strong> type I<br />
(i) Obt<strong>en</strong>tion <strong><strong>de</strong>s</strong> t<strong>en</strong>dons<br />
L’extraction se fait à partir <strong>de</strong> t<strong>en</strong>dons <strong>de</strong> queue <strong>de</strong> rat, sous une hotte à flux laminaire stérile.<br />
Pour récupérer les t<strong>en</strong>dons, il faut serrer la queue à 1 cm <strong>de</strong> son extrémité fine et à l’ai<strong>de</strong><br />
d’une pince (type coupe-ongles) casser la vertèbre par rotation du poignet et tirer pour sortir<br />
le t<strong>en</strong>don. L’opération est répétée <strong>de</strong> cm <strong>en</strong> cm <strong>en</strong> remontant, <strong>en</strong> s’arrêtant à <strong>en</strong>viron 3 cm <strong>de</strong><br />
la base <strong>de</strong> la queue. Les t<strong>en</strong>dons ainsi prélevés sont plongés dans un bécher <strong>de</strong> PBS 1X.<br />
(ii) Lavage <strong><strong>de</strong>s</strong> t<strong>en</strong>dons prélevés<br />
Les t<strong>en</strong>dons doiv<strong>en</strong>t être lavés abondamm<strong>en</strong>t pour éliminer toutes les traces <strong>de</strong> sang. La<br />
première étape consiste à c<strong>en</strong>trifuger plusieurs fois les t<strong>en</strong>dons (4°C, 4400 tours/min, 5min)<br />
<strong>en</strong> les rinçant avec du PBS 1X. Lorsque le surnageant est limpi<strong>de</strong> et incolore, les t<strong>en</strong>dons sont<br />
plongés dans une solution <strong>de</strong> NaCl 4M pour induire l’éclatem<strong>en</strong>t cellulaire par choc<br />
osmotique et évacuer les év<strong>en</strong>tuelles traces <strong>de</strong> sang et d’albumine. Enfin, les t<strong>en</strong>dons sont à<br />
nouveau rincés dans du PBS 1X et c<strong>en</strong>trifugés plusieurs fois (4°C, 4400 tours/min, 5 min)<br />
pour élimer un maximum <strong>de</strong> sel et les débris cellulaires.<br />
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