Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
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tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
dommage) à IV (ADN presque uniquem<strong>en</strong>t localisé dans la queue <strong>de</strong> la comète) (figure 6.4).<br />
Les effets sont ainsi quantifiés par comparaison avec un témoin négatif et positif.<br />
Figure 6-4: Différ<strong>en</strong>tes classes <strong>de</strong> comètes <strong>en</strong> fonction du dommage causé à l’ADN<br />
Protocole opératoire (Speit 2005): Les cellules ont adhéré dans <strong><strong>de</strong>s</strong> plaques 24 puits (50,000<br />
cellules par puits) 24 heures avant d’être exposées p<strong>en</strong>dant 24 heures aux <strong>nanoparticules</strong>.<br />
Après avoir retiré le <strong>milieu</strong> <strong>de</strong> culture, les cellules sont rincées avec du PBS 1X avant d’être<br />
décollées avec 200 µL <strong>de</strong> trypsine (5 minutes dans l’incubateur à 37°C). Les cellules sont<br />
resusp<strong>en</strong>dues dans du PBS 1X, puis 50 µL <strong>de</strong> cette susp<strong>en</strong>sion sont mélangés à 500 µL<br />
d’agarose à bas point <strong>de</strong> fusion préparé dans du PBS 1X (125 mg d’agarose dans 20 mL <strong>de</strong><br />
PBS 1X). 50 µL <strong>de</strong> ce mélange sont disposés <strong>en</strong> doublons sur <strong><strong>de</strong>s</strong> lames pré-traitées (Comet<br />
Sli<strong><strong>de</strong>s</strong>, Trevig<strong>en</strong>). Les lames sont mises 20 minutes à 4°C pour laisser l’agarose polymériser<br />
avant d’être plongées dans un bain <strong>de</strong> lyse p<strong>en</strong>dant 2 heures. Ensuite les lames sont déposées<br />
sur l’électrophorèse horizontale à 4°C dans le tampon d’électrophorèse p<strong>en</strong>dant 30 minutes<br />
sans courant, puis une t<strong>en</strong>sion <strong>de</strong> 25 V et un courant <strong>de</strong> 300 mA sont appliqués p<strong>en</strong>dant 45<br />
minutes. A la suite <strong>de</strong> l’électrophorèse, les lames sont plongées dans un bain <strong>de</strong> neutralisation<br />
(Tris-HCl 0,4 M pH 7,5) avant d’être déshydratées dans l’éthanol. Enfin, l’ADN est marqué<br />
avec du DAPI (50 µL par gel d’une solution à 5 µg/mL dans PBS 1X, 20 minutes). Pour<br />
terminer, les lames sont analysées avec un microscope à epi-fluoresc<strong>en</strong>ce possédant un filtre à<br />
445 nm. Un minimum <strong>de</strong> 100 comètes est analysé et classé par catégorie <strong>de</strong> dommages à<br />
l’ai<strong>de</strong> du logiciel CellProfiler.<br />
Solutions utilisées :<br />
Solution <strong>de</strong> lyse :<br />
Solution mère : 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g), 10 mM Tris-HCl (1,2 g), pH<br />
10 (NaOH 8,0 g <strong>en</strong>viron), H20 (890 mL)<br />
Solution finale : Triton X-100 (1 mL), DMSO (10 mL), Solution mère (89 mL)<br />
Tampon d’électrophorèse : 300 mM NaOH, 1 mM EDTA<br />
Toutes les solutions sont préparées juste avant utilisation et conservées à 4°C.<br />
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