Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
dommage) à IV (ADN presque uniquement localisé dans la queue de la comète) (figure 6.4).
Les effets sont ainsi quantifiés par comparaison avec un témoin négatif et positif.
Figure 6-4: Différentes classes de comètes en fonction du dommage causé à l’ADN
Protocole opératoire (Speit 2005): Les cellules ont adhéré dans des plaques 24 puits (50,000
cellules par puits) 24 heures avant d’être exposées pendant 24 heures aux nanoparticules.
Après avoir retiré le milieu de culture, les cellules sont rincées avec du PBS 1X avant d’être
décollées avec 200 µL de trypsine (5 minutes dans l’incubateur à 37°C). Les cellules sont
resuspendues dans du PBS 1X, puis 50 µL de cette suspension sont mélangés à 500 µL
d’agarose à bas point de fusion préparé dans du PBS 1X (125 mg d’agarose dans 20 mL de
PBS 1X). 50 µL de ce mélange sont disposés en doublons sur des lames pré-traitées (Comet
Slides, Trevigen). Les lames sont mises 20 minutes à 4°C pour laisser l’agarose polymériser
avant d’être plongées dans un bain de lyse pendant 2 heures. Ensuite les lames sont déposées
sur l’électrophorèse horizontale à 4°C dans le tampon d’électrophorèse pendant 30 minutes
sans courant, puis une tension de 25 V et un courant de 300 mA sont appliqués pendant 45
minutes. A la suite de l’électrophorèse, les lames sont plongées dans un bain de neutralisation
(Tris-HCl 0,4 M pH 7,5) avant d’être déshydratées dans l’éthanol. Enfin, l’ADN est marqué
avec du DAPI (50 µL par gel d’une solution à 5 µg/mL dans PBS 1X, 20 minutes). Pour
terminer, les lames sont analysées avec un microscope à epi-fluorescence possédant un filtre à
445 nm. Un minimum de 100 comètes est analysé et classé par catégorie de dommages à
l’aide du logiciel CellProfiler.
Solutions utilisées :
Solution de lyse :
Solution mère : 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g), 10 mM Tris-HCl (1,2 g), pH
10 (NaOH 8,0 g environ), H20 (890 mL)
Solution finale : Triton X-100 (1 mL), DMSO (10 mL), Solution mère (89 mL)
Tampon d’électrophorèse : 300 mM NaOH, 1 mM EDTA
Toutes les solutions sont préparées juste avant utilisation et conservées à 4°C.
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