Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Figure 6-3: Réaction du test à la résazurine
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
Protocole : Après exposition aux nanoparticules, le milieu est retiré et les cellules sont
incubées 4 heures avec 100 µL de milieu sans rouge phénol contenant 10% de résazurine à
440 µM. Au terme de cette incubation, le milieu est prélevé et la DO mesurée à 570 nm
(résofurine) et 600 nm (résazurine). Les cellules sont rincées avec du milieu neuf et la culture
est poursuivie pour étudier la toxicité aux temps d’exposition plus longs.
Calcul du % de résazurine réduit par rapport au contrôle négatif (milieu + résazurine sans
cellules):
% =
εox(600) = 117,216 mol -1 .L.cm -1
ε ox (600)A(570) −ε ox (570)A(600)
ε ox(600)A°(570) −ε ox(570)A°(600)
εox(570) = 80,586 mol
€
-1 .L.cm -1
A( ) = absorbance à la longueur d’onde (570 ou 600 nm) de l’échantillon
A°( ) = absorbance à la longueur d’onde (570 ou 600 nm) du témoin négatif
(iii) Génotoxicité : test des comètes en conditions basiques
Principe : Le test des comètes permet la détection d’un endommagement de l’ADN (Collins
2004). Un nombre limité de cellules est suspendu dans un gel d’agarose pour effectuer une
électrophorèse. Les cellules sont lysées dans une solution à haute teneur en sel et en détergent,
formant ainsi des nucléoides contenant l’ADN. Lors de l’électrophorèse, l’ADN intact va
migrer sous forme d’une sphère compacte, tandis que l’ADN ayant été endommagé va
présenter des fragments plus courts qui vont davantage migrer vers l’anode, formant ainsi une
forme ressemblant à une comète. En conditions alcalines, ce test permet de révéler les
ruptures de chaines simple et double brins, ainsi que les sites alcali-labiles. L’intensité ainsi
que la longueur de la queue des comètes dépendent de l’importance des dommages causés à
l’ADN. L’analyse des comètes permet ainsi une quantification des effets observés en
regroupant les comètes par classe en fonction de l’intensité et longueur de queue, de 0 (pas de
195