Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
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tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
Figure 6-3: Réaction du test à la résazurine<br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
Protocole : Après exposition aux <strong>nanoparticules</strong>, le <strong>milieu</strong> est retiré et les cellules sont<br />
incubées 4 heures avec 100 µL <strong>de</strong> <strong>milieu</strong> sans rouge phénol cont<strong>en</strong>ant 10% <strong>de</strong> résazurine à<br />
440 µM. Au terme <strong>de</strong> cette incubation, le <strong>milieu</strong> est prélevé et la DO mesurée à 570 nm<br />
(résofurine) et 600 nm (résazurine). Les cellules sont rincées avec du <strong>milieu</strong> neuf et la culture<br />
est poursuivie pour étudier la toxicité aux temps d’exposition plus longs.<br />
Calcul du % <strong>de</strong> résazurine réduit par rapport au contrôle négatif (<strong>milieu</strong> + résazurine sans<br />
cellules):<br />
% =<br />
εox(600) = 117,216 mol -1 .L.cm -1<br />
ε ox (600)A(570) −ε ox (570)A(600)<br />
ε ox(600)A°(570) −ε ox(570)A°(600)<br />
εox(570) = 80,586 mol<br />
€<br />
-1 .L.cm -1<br />
A( ) = absorbance à la longueur d’on<strong>de</strong> (570 ou 600 nm) <strong>de</strong> l’échantillon<br />
A°( ) = absorbance à la longueur d’on<strong>de</strong> (570 ou 600 nm) du témoin négatif<br />
(iii) Génotoxicité : test <strong><strong>de</strong>s</strong> comètes <strong>en</strong> conditions basiques<br />
Principe : Le test <strong><strong>de</strong>s</strong> comètes permet la détection d’un <strong>en</strong>dommagem<strong>en</strong>t <strong>de</strong> l’ADN (Collins<br />
2004). Un nombre limité <strong>de</strong> cellules est susp<strong>en</strong>du dans un gel d’agarose pour effectuer une<br />
électrophorèse. Les cellules sont lysées dans une solution à haute t<strong>en</strong>eur <strong>en</strong> sel et <strong>en</strong> déterg<strong>en</strong>t,<br />
formant ainsi <strong><strong>de</strong>s</strong> nucléoi<strong><strong>de</strong>s</strong> cont<strong>en</strong>ant l’ADN. Lors <strong>de</strong> l’électrophorèse, l’ADN intact va<br />
migrer sous forme d’une sphère compacte, tandis que l’ADN ayant été <strong>en</strong>dommagé va<br />
prés<strong>en</strong>ter <strong><strong>de</strong>s</strong> fragm<strong>en</strong>ts plus courts qui vont davantage migrer vers l’ano<strong>de</strong>, formant ainsi une<br />
forme ressemblant à une comète. En conditions alcalines, ce test permet <strong>de</strong> révéler les<br />
ruptures <strong>de</strong> chaines simple et double brins, ainsi que les sites alcali-labiles. L’int<strong>en</strong>sité ainsi<br />
que la longueur <strong>de</strong> la queue <strong><strong>de</strong>s</strong> comètes dép<strong>en</strong><strong>de</strong>nt <strong>de</strong> l’importance <strong><strong>de</strong>s</strong> dommages causés à<br />
l’ADN. L’analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> comètes permet ainsi une quantification <strong><strong>de</strong>s</strong> effets observés <strong>en</strong><br />
regroupant les comètes par classe <strong>en</strong> fonction <strong>de</strong> l’int<strong>en</strong>sité et longueur <strong>de</strong> queue, <strong>de</strong> 0 (pas <strong>de</strong><br />
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