Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
(v) Mesure de l’intensité de fluorescence des particules internalisées
Afin de comparer l’internalisation des différentes particules observées par fluorescence,
l’intensité de fluorescence de la FITC au niveau des cellules est mesurée sur les images de
microscopie à fluorescence. Pour ce faire, la zone correspondant à une cellule est définie
grâce au marqueur membranaire WGA-AlexaFluor555, et l’intensité du signal de la FITC est
sommée sur cette zone à l’aide du logiciel CellProfiler. Pour éviter de comptabiliser des
particules à la surface des cellules, des cellules ne présentant pas d’agrégats de particules en
surface ont été sélectionnées.
6.2.3.3 Etude de la toxicité
Chaque expérience est réalisée au moins en triplet, les différences sont évaluées avec une
analyse statistique (test Student si les résultats suivent une distribution normale (déterminé
par un test de normalité Shapiro-Wilk) et Wilcoxon-Mann-Whitnet pour les autres)
(i) Comptage cellulaire par la technique du bleu trypan
Après exposition aux nanoparticules, les cellules sont décollées comme décrit dans le
protocole de culture cellulaire (§ 6.2.3.1). Elles sont ensuite comptées en utilisant le bleu
trypan. Cette technique permet de colorer en bleu les cellules mortes, tout en laissant les
cellules vivantes non colorées. En effet, ce colorant, une fois entré dans les cellules, provoque
un mécanisme d’exclusion le rejetant dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessite de
l’énergie et ne peut donc avoir lieu que dans les cellules vivantes ayant une source d’ATP.
Ces dernières apparaissent donc non colorées au microscope tandis que les cellules mortes
prennent une coloration bleue. Pour cela, 100 µL d’une solution de bleu Trypan (0,4% dans
du PBS 1X) sont ajoutés à 0,5 mL d’une suspension cellulaire. Après homogénéisation, les
cellules vivantes non colorées sont comptées avec un hémacytomètre.
(ii) Cytotoxicité : test à la résazurine
Les cellules vivantes réduisent la résazurine bleue en résofurine rose (schéma 6.3). L’intensité
de coloration obtenue est proportionnelle au nombre de cellules vivantes.
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