Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...
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tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013<br />
Chapitre 6 : Protocoles expérim<strong>en</strong>taux<br />
solution <strong>de</strong> tétraoxy<strong>de</strong> d’osmium à 2% dans un mélange tampon cacodylate (0,1 M, pH<br />
7,4)/saccharose 0,3 M. Les échantillons sont <strong>en</strong>suite rincés dans trois bains du tampon <strong>de</strong><br />
rinçage. Après rinçage, les cellules sont récupérées à l’ai<strong>de</strong> d’un grattoir et c<strong>en</strong>trifugées dans<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> epp<strong>en</strong>dorfs. Jusqu’à l’inclusion finale, les cellules sont gardées sous forme <strong>de</strong> culot dans<br />
les epp<strong>en</strong>dorfs et rec<strong>en</strong>trifugées si nécessaire (1000 rpm, temps ajusté, <strong>en</strong> fonction <strong>de</strong> la<br />
viscosité, pour avoir un culot).<br />
Les échantillons sont <strong>en</strong>suite déshydratés par passage dans <strong><strong>de</strong>s</strong> bains d’éthanol <strong>de</strong> 5 minutes à<br />
50%, 70% et 95%, puis <strong>en</strong>fin <strong>de</strong>ux bains <strong>de</strong> 10 minutes d’éthanol à 100%. A la suite <strong>de</strong> cette<br />
déshydratation, l’éthanol est remplacé par <strong>de</strong> l’oxy<strong>de</strong> <strong>de</strong> propylène (un premier bain 50 :50<br />
éthanol et oxy<strong>de</strong> <strong>de</strong> propylène puis un bain d’oxy<strong>de</strong> <strong>de</strong> propylène pur).<br />
Inclusion : Les échantillons déshydratées sont inclus dans <strong>de</strong> l’araldite (composition : 20 mL<br />
araldite CY212, 22 mL d’anydri<strong>de</strong> dodécyl succinique, ag<strong>en</strong>t durcisseur, 1,1 mL <strong>de</strong> b<strong>en</strong>zyl<br />
dimethyl amine, accélérateur). Cette inclusion se fait d’abord par imprégnation progressive<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> pièces placées dans <strong><strong>de</strong>s</strong> mélanges araldite/ oxy<strong>de</strong> <strong>de</strong> propylène (0,25/0,75 p<strong>en</strong>dant 1 heure<br />
puis 0,75/0,25 p<strong>en</strong>dant 1 nuit à 4°C). Ensuite les pièces sont placées dans <strong>de</strong> l’araldite pure<br />
p<strong>en</strong>dant 3 heures <strong>en</strong> changeant l’araldite après 1 heure. Enfin les échantillons sont placés dans<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> moules remplis d’araldite et mis à polymériser p<strong>en</strong>dant 3 jours dans une étuve à 60°C.<br />
Les blocs sont coupés <strong>en</strong> sections ultrafines <strong>de</strong> 70 nm à l’ai<strong>de</strong> d’un ultramicrotome (Ultracut<br />
Reichert Young). Ces coupes sont déposées sur <strong><strong>de</strong>s</strong> grilles <strong>de</strong> cuivre.<br />
Selon les échantillons, les coupes sont contrastées à l’aci<strong>de</strong> phosphotungstique, à l’acétate<br />
d’uranyle ou sont observées sans contraste supplém<strong>en</strong>taire.<br />
Les coupes ultrafines <strong>de</strong> cellules fixées à différ<strong>en</strong>ts temps sont observées à l’ai<strong>de</strong> d’un<br />
microscope FEI opérant à 120 kV.<br />
(iv) Internalisation <strong>en</strong> prés<strong>en</strong>ce d’inhibiteurs<br />
Afin <strong>de</strong> déterminer quelle voie d’internalisation est mise <strong>en</strong> œuvre, les cellules sont incubées<br />
avec <strong><strong>de</strong>s</strong> inhibiteurs <strong><strong>de</strong>s</strong> voies clathrine et caveolae. Les cellules sont respectivem<strong>en</strong>t incubées<br />
3 heures avec une solution à 50 µM <strong>de</strong> monodansylcadaverine et 30 minutes avec une<br />
solution à 5 µg/mL <strong>de</strong> filipine ou 10 -8 M <strong>de</strong> phorbol myristate acetate, avant d’ajouter les<br />
<strong>nanoparticules</strong> <strong>en</strong> susp<strong>en</strong>sion dans le <strong>milieu</strong> avec l’inhibiteur. Ensuite, les cellules sont fixées<br />
et observées <strong>en</strong> microscopie à fluoresc<strong>en</strong>ce, comme décrit précé<strong>de</strong>mm<strong>en</strong>t.<br />
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