Comportement des nanoparticules de silice en milieu biologique ...

tel-00836093, version 1 - 20 Jun 2013
Chapitre 6 : Protocoles expérimentaux
solution de tétraoxyde d’osmium à 2% dans un mélange tampon cacodylate (0,1 M, pH
7,4)/saccharose 0,3 M. Les échantillons sont ensuite rincés dans trois bains du tampon de
rinçage. Après rinçage, les cellules sont récupérées à l’aide d’un grattoir et centrifugées dans
des eppendorfs. Jusqu’à l’inclusion finale, les cellules sont gardées sous forme de culot dans
les eppendorfs et recentrifugées si nécessaire (1000 rpm, temps ajusté, en fonction de la
viscosité, pour avoir un culot).
Les échantillons sont ensuite déshydratés par passage dans des bains d’éthanol de 5 minutes à
50%, 70% et 95%, puis enfin deux bains de 10 minutes d’éthanol à 100%. A la suite de cette
déshydratation, l’éthanol est remplacé par de l’oxyde de propylène (un premier bain 50 :50
éthanol et oxyde de propylène puis un bain d’oxyde de propylène pur).
Inclusion : Les échantillons déshydratées sont inclus dans de l’araldite (composition : 20 mL
araldite CY212, 22 mL d’anydride dodécyl succinique, agent durcisseur, 1,1 mL de benzyl
dimethyl amine, accélérateur). Cette inclusion se fait d’abord par imprégnation progressive
des pièces placées dans des mélanges araldite/ oxyde de propylène (0,25/0,75 pendant 1 heure
puis 0,75/0,25 pendant 1 nuit à 4°C). Ensuite les pièces sont placées dans de l’araldite pure
pendant 3 heures en changeant l’araldite après 1 heure. Enfin les échantillons sont placés dans
des moules remplis d’araldite et mis à polymériser pendant 3 jours dans une étuve à 60°C.
Les blocs sont coupés en sections ultrafines de 70 nm à l’aide d’un ultramicrotome (Ultracut
Reichert Young). Ces coupes sont déposées sur des grilles de cuivre.
Selon les échantillons, les coupes sont contrastées à l’acide phosphotungstique, à l’acétate
d’uranyle ou sont observées sans contraste supplémentaire.
Les coupes ultrafines de cellules fixées à différents temps sont observées à l’aide d’un
microscope FEI opérant à 120 kV.
(iv) Internalisation en présence d’inhibiteurs
Afin de déterminer quelle voie d’internalisation est mise en œuvre, les cellules sont incubées
avec des inhibiteurs des voies clathrine et caveolae. Les cellules sont respectivement incubées
3 heures avec une solution à 50 µM de monodansylcadaverine et 30 minutes avec une
solution à 5 µg/mL de filipine ou 10 -8 M de phorbol myristate acetate, avant d’ajouter les
nanoparticules en suspension dans le milieu avec l’inhibiteur. Ensuite, les cellules sont fixées
et observées en microscopie à fluorescence, comme décrit précédemment.
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